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　　【化工儀器網 科技前沿】10月28日，中科院城市環境研究所崔麗研究員團隊應用辰英核心產品——單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS，在期刊《Analytical Chemistry》上發表文章“Phenotypic Tracking of Antibiotic Resistance Spread via Transformation from Environment to Clinic by Reverse D2O Single-Cell Raman Probing”。
 

 

　　01 研究背景
 

　　微生物耐藥是一個危害公共衛生安全的性問題。耐藥基因(antibiotic resistance gene，ARG)在環境或臨床中出現并傳播擴散。在這一過程中，水平基因轉移(Horizontal gene transfer，HGT)現象起著不可忽視的作用。HGT的一個主要途徑是轉化(transformation)——受體細菌攝取胞外DNA(extracelluar DNA，eDNA)。這些eDNA多是細菌主動分泌或者裂解過程中釋放的質粒DNA以及片段化DNA，常常攜帶著ARG。環境充當著ARG儲庫的角色，威脅著臨床治療。因此了解ARG從環境到臨床轉移的過程是必要的。
 

　　在上述問題的研究中，常規方法依賴耐藥菌的選擇性培養或是報告基因標記eDNA技術。前者需要已知被篩選微生物的培養條件，且無法篩選出耐藥但擴增不活躍的微生物。后者需要對eDNA等進行改造，不能反應實際的HGT情況。
 

　　近年新興了一種聯合正向D2O標記的單細胞拉曼光譜方法用于微生物抗性區分。微生物利用環境中的D2O合成相關的生物分子，可以通過拉曼光譜的C-D帶(2040-2300 cm-1)進行表征。抗性環境中敏感菌與耐藥菌會表現出不同D2O攝入，進而表現出不同的C-D峰情況。然而微生物不僅攝入D2O，還會攝入其他含H元素的營養物質，這導致單位時間C-D譜帶的增長較低。同時較短時間的孵育也降低了該方法的靈敏度。作者團隊改進并提出了反向D2O-單細胞-拉曼檢測技術(reverse D2O single-cell Raman (Raman-rD2O) probing，Raman-rD2O)。微生物預先在D2O中孵育，后置換為含抗生素的H2O環境孵育并被檢測。作者確定了該方法的有效性并利用該方法研究了HGT過程.。
 

　　02 實驗設計
 

　　這項研究中，為了評價微生物耐藥性，作者建立了Raman-rD2O方法，確定了其有效性，以及靈敏度。之后在大腸桿菌體系中確認了水平基因轉移的情況。接著評價了與來自于復雜環境中質粒共孵育的大腸桿菌對各抗生素(meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin)的耐藥情況，并確認了該方法比傳統培養方法更加準確。后提出了一種用于反映ARGs傳播風險的計算方法。
 

　　03 結果討論
 

　　Raman-rD2O方法區分耐藥菌以及敏感菌的靈敏度
 

　　對colistin耐藥的FIT10(B. cereus)以及colistin敏感的DH5α(E. coli)菌株進行D2O培養12h。轉移至含抗生素colistin的無D2O環境進行培養，取不同時間點進行拉曼圖譜采集，結果如圖 1。在C-D峰處可以看出，耐藥菌FIT10峰強逐漸變低，非耐藥菌DH5α無明顯變化。
 

 

　　圖 1. 預先標記同位素D微生物在含0.125 mg/L colistin的LB培養基中培養0、0.5、1、4、8小時后的單細胞拉曼光譜(a)耐藥菌FIT10，(b)敏感菌DH5α。
 

　　采集含colistin培養條件下FIT10以及DH5α的單細胞拉曼圖譜并統計C-D比值(CD/(CD + CH))，結果如圖 2a-Ⅰ。另外比較了含ampicillin條件下的DH5α-Ampr以及DH5α數據，如圖 2a-Ⅲ。可以看出該方法能夠區分耐藥菌以及敏感菌，且適用不同抗生素。
 

　　從圖 2a-Ⅱ/Ⅲ以及2b數據，可以看出正向標記方法4h后才能觀察到差異。因此反向標記方法是優于正向標記的。
 

 

　　圖 2. (a-Ⅰ，a-Ⅲ) 反向D2O方法下，不同時間點的colistin耐藥FIT10、ampicilin耐藥DH5α-Ampr以及DH5α的C-D比值統計結果；(a-Ⅲ，a-Ⅳ) 正向D2O方法下結果；(b) 1×MIC抗生素濃度下培養1h，反向D2O、正向D2O的單細胞拉曼圖譜C-D區域結果。
 

　　利用Raman-rD2O方法揭示轉化過程中ARGs的水平基因轉移
 

　　作者比較了實驗組JM109(E . coli)以及對照組DH5α、DH5α-Ampr 菌C-D比值。JM109預先與攜帶bla基因(編碼抗ampicilin蛋白)的pMD19-T質粒共孵育。從圖 3可以看出，DH5α組維持高的C-D比值，DH5α-Ampr 組比值降至6.4%以下。而JM109組分為了高比值群體以及低比值群體。這意味著JM109組中部分微生物獲得了bla基因并表達，從而能在含ampicilin環境中進行代謝生長。
 

　　為了驗證這一假設，作者利用本公司(HOOKE instruments)產品單細胞分選儀(PRECI SCS)，對各樣品進行了單個細胞分選。對分選的單個微生物進行全基因組擴增后，通過PCR驗證bla基因的攜帶情況。從圖 3b可看出，DH5α組無bla基因，DH5α-Ampr 組攜帶bla基因，部分JM109組攜帶bla基因。這一結果印證了bla基因轉移的假設。
 

　　作者統計了不同采集個數下耐藥菌個數并計算了轉化頻率(Transformation Frequency = 轉化菌個數/(10×拉曼采集總數)，10為微生物1h時擴增倍數)。采集數目大于40時，轉化頻率趨近4.33 × 10-2。該結果與傳統平板培養方法得到的5.07 × 10-2一致。
 

 

　　圖 3. (a)預標記同位素D的E. coli DH5α(敏感對照)，E. coli DH5α-Ampr(抵抗對照)以及轉化了含bla基因質粒的接受菌E. coli ，經過含ampicillin的LB培養基孵育1h，采集拉曼光譜并統計C-D比率。每個點對應一個拉曼結果。閾值6.4%為未經過D標記的抗性轉化子的C-D比值的平均值+3倍標準偏差；(b)PCR產物(針對質粒上bla基因)的電泳結果，1-3道為高C-D比值的敏感接受菌，4-6為小于10% C-D比值的耐藥接受菌，7為不含質粒的E. coli DH5α，8為含bla基因的E. coli DH5α-Ampr；(c)質粒(攜帶bla基因)的轉化頻率(線)以及轉化頻率的標準偏差(柱)。利用單細胞Raman-rD2O方法對不同拉曼圖譜采集個數下結果進行了統計。
 

　　通過單細胞Raman-rD2O評價復雜環境中質粒介導的eARGs轉化現象
 

　　作者提取了土壤中的質粒并與E. coli共孵育。通過單細胞Raman-D2O，分析了不同抗生素下(meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin)的拉曼C-D比值。從圖 4a可以看出，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin組出現了水平基因轉移現象?？紤]到土壤等環境中質粒對受體微生物增殖能力的影響，不同質粒編碼導致同一抗性等問題，作者引入了傳播效率(Spread Efficiency = 轉化菌個數/拉曼采集總數)來評估傳播風險。就圖 4b結果來說，傳播效率ampicillin(1.5 × 10-1) > cefradine(8.6 × 10-2)和ciprofloxacin(6.7 × 10-2) >meropene(0)m和 vancomycin(0)。
 

　　作者同時計算了Raman rD2O方法的轉化效率，ampicillin (1.9 × 10-3)> ciprofloxacin (5.9 × 10-4) and cefradine (8.8 × 10-4) >meropenem and vancomycin (0) 。而傳統平皿培養方法下的轉化效率數值小于上述80-100倍。傳統方法低估了HGT的程度，一方面存在攜帶抗性基因但在環境下不可培養鑒定的微生物(viable but nonculturable，VBNC)，另一方面存在接受質粒導致擴增速率大幅降低(1000倍)的微生物。而在傳統方法中過夜培養后，這種差異變得更加的明顯。
 

 

　　圖 4. (a) E. coli DH5α(敏感對照)C-D比值，以及接受菌E. coli 的C-D比值。接受菌經同位素D預標記后，與從土壤提取質粒進行共孵育。后分別在meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin條件下孵育1h。每一個點對應一個單細胞拉曼圖譜。C-D比值小于6.4%的為不帶D標記的耐受轉化子；(b)攜帶抗meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin基因的質粒的傳播效率。星號表示比較具有統計學意義(單因素方差分析ANOVA，P< 0.001)。
 

　　04 結論
 

　　利用單細胞拉曼反向D2O檢測方法能夠可靠且快速的從表型上追蹤耐藥從環境到臨床的擴散。方法具有很高的靈敏度，能夠在大量受體菌種識別出那些少量的抗性轉化子。單細胞水平的檢測避免了繁瑣的培養過程，可以直接計算傳播效率，能夠表征臨床相關抗生素的不同風險。該方法后續未來可用于破解影響抗性質粒轉移以及持續的因素。通過與基因型研究的聯系，能更好的理解環境質體(environmental plastidome)傳播風險。也是一種研究HGT機制的新手段。
 

　　辰英科儀自主研制的單細胞分選儀PRECI SCS具有獨特的可視化分選功能，所見即所得，精準實現目標細胞的逐一分離。采用獨特的激光與物質相互作用原理，對于復雜生物樣本中形態各異的細胞，可實現非標記狀態下的精準分離。對于百納米級的單個微生物細胞也同樣適用。
 

 

　　圖5. 單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS
 

 

　　圖6. 拉曼單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS-R300
 

　　PRECI SCS具有可視化、廣泛適用等特點。分選過程不依賴標記，可與形態、拉曼、熒光等多種識別方式結合，多種機型可選，滿足不同應用需求。搭載潛心研制的HOOKE IntP智能軟件，實現單細胞圖像智能識別、一鍵自動分選、全自動細胞獲取等。設備操作流程簡易，為單細胞測序、未培養微生物開發、工程細胞篩選、細胞圖譜繪制等研究提供解決方案，助力前沿科學研究。