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一、實驗要求： 

     1、掌握從土壤中提取微生物的實驗原理。

     2、掌握倒平板的技術和分離純化大腸桿菌的基本操作技術。 

     3、能通過后續實驗對目的菌做出簡單生化鑒定。 

二、實驗目的：從土壤中分離提取大腸桿菌。

三、實驗背景：

     1、大腸桿菌生物學分類：細菌域，變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科，埃希氏菌屬，大腸桿菌種

     2、大腸桿菌形態特征：革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發酵多種糖類產酸、產氣，兼性厭氧菌。該菌在自然界的水中可存活數周至數月，在溫度較低的糞便中存活更久。膽鹽、煌綠等對大腸桿菌有抑制作用。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，但易耐藥，是由帶有R因子的質粒轉移而獲得的。 

四、器材與試劑：

①土鏟、盛9m1無菌水的試管、三角燒瓶、盛100m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、火柴、無菌培養皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、量筒、吸水紙、燒杯、電爐、石棉網、鑷子、恒溫培養箱、生化培養箱 高溫滅菌鍋、電子天平、天平、pH試紙、擦鏡紙、棉花、紗布、報紙、試管架、試管夾、標簽、記號筆、放大鏡、載物盤等。②蒸餾水、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂 、K2HPO4、NaCl、乳糖、2%伊紅Y溶液、0.35%美藍溶液、檸檬酸鐵銨、Na2S2O3·5H2O（硫代硫酸鈉）、3%～10%過氧化氫、香柏油、草酸銨結晶紫染液、革蘭氏碘液、95%乙醇、番紅染液

五、實驗內容： 

     1、制作牛肉膏蛋白胨培養基、伊紅美藍培養基。

     2、對培養基、滴管、試管、玻璃棒等器材進行高溫滅菌處理。

     3、用稀釋法從土壤中分離細菌。 

     4、將樣品接種到伊紅美藍平板上進行分離。

     5、觀察外部特征、鏡檢，將疑似大腸桿菌菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面上，進行擴大培養。

     6、對菌種進行生化反應并簡單鑒定。

六、實驗步驟：

     1、培養基的配制

        ①牛肉膏蛋白胨培養基

   配方：牛肉膏（1克）；蛋白胨（2克）；氯化鈉（1克 ）；瓊脂 （4克 ）；水（200毫升） 

   方法：在燒杯內加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外作上記號后，放在火上加熱。待燒杯內各組分溶解后，加入瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂*溶解后補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2～7.6,分裝在各個試管里，加棉花塞，制斜面。

        ②伊紅美藍培養基

　 配方：乳糖 （2克），蛋白胨 （2克），NaCl  （1克），K2HPO4  （1克），2%伊紅水溶液 （4毫升），0.35%美藍水溶液 （4毫升），瓊脂 （4克），水 （200毫升），pH 7.1  注：先調PH，滅菌在加乳糖、伊紅、美藍

   方法：先配200毫升蛋白胨水瓊脂培養基加熱溶化，冷卻至60℃左右時，再把已滅菌的乳糖溶液、伊紅水溶液及美藍水溶液按上述量以無菌操作加入。搖勻后，立即倒平板（見第三步）。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴格控制滅菌溫度，一般是0．70kg/cm2　（10磅/英寸2　），115．2℃滅菌20分鐘。

       ③檸檬酸鐵銨半固體培養基。（用于生化反應中H2S試驗）

   配方：蛋白胨 （2克），NaCl （1克），檸檬酸鐵銨 （0.1克），硫代硫酸鈉 （0.1克），瓊脂 （1.2克），蒸餾水 （200毫升），PH 7.6 

    2、將所需器材高溫滅菌，備用。

    3、倒平板 ：需要倒三皿，防止失敗可多做幾皿。其方法是右手持盛伊紅美藍培養基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果試管內或三角燒瓶內的培養基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養皿，再注入培養基，搖勻后制成平板。分別標號10-4、10-5、10-6。

    4、土壤稀釋液的制備：在沈陽大學4號樓門前樹林內選取土樣，稱取土壤1g，放入99mL無菌水的三角瓶中，振蕩10min，即為稀釋10－2的土壤懸液。另取裝有9mL無菌水試管4支，用記號筆編上10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀釋成10－2的土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌吸管吸取1mL土壤懸液加入10－3的無菌水的試管中，并在試管內輕輕吹吸數次，使之充分混勻，即成10－3土壤稀釋液。同法依次連續稀釋至10－4 ，10－5，10－6土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，應用一支吸管由濃到稀，稀釋到底。

    5、涂布接種：稀釋完畢后，可用原來的移液管，從菌液濃度zui小的10-6的稀釋液開始吸取1ml 10-6稀釋液，加到相應編號10-6的無菌培養皿內，以相同方法分別吸取1ml10-5、10-4的稀釋液加到相應編號為10-5、10-4的無菌培養皿內。用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻。37℃恒溫箱培養48小時。

    6、觀察初檢：三種菌種濃度的培養皿中均會出現大腸桿菌菌落，尋找菌落中心呈暗藍黑色，發金屬光澤的菌種。并進行鏡檢, 觀察。

    7、擴大培養：將疑似菌落接種于斜面培養基上，進行擴大培養。37℃培養48小時。

    8、生化鑒定：

      ①革蘭氏染色：經革蘭氏染色可見革蘭氏陰性的短桿菌, 兩端鈍圓。散在或成對存在； 

      ②硫化氫試驗：用檸檬酸鐵銨半固體培養基接種待檢菌種；

      ③過氧化氫試驗。

    9、觀察實驗結果，并記錄，整理器材。