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                       LightCycler應用--甲基化分析

主要應用:
應用實時熒光PCR技術進行快速準確的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內容之一，它可以在轉錄水平抑制基因的表達。具體的過程是在胞嘧啶－鳥嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一個額外的甲基團，形成5－甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度較高的區域在人體基因組中呈非隨機分布于，優先分布于基因的啟動子區，并被稱為CpG島[1]。對于癌癥，其基因組的甲基化分布發生變化[2]。正常狀態下應甲基化的區域未甲基化，而癥狀狀態下非甲基化區域出現甲基化，例如CpG島相關啟動子呈超甲基化。這可導致受累基因座的染色質結構發生變化，致使基因沉默。啟動子超甲基化可導致有關腫瘤演進的重要基因再次沉默，例如那些有關DNA修復、細胞周期調控和凋亡的基因。因此，可以認為DNA甲基化與腫瘤研究密切相關。腫瘤中某些基因的DNA甲基化狀態的變化通過其生物學特征反映出來。因此，評估DNA甲基化的快速高通量方法對研究者和臨床醫生在診斷、治療和預后都非常有實用價值[3].
當前對于DNA甲基化研究，普遍使用的方法有甲基化特異性PCR，變性液相色譜法（DHPLC），聯合亞硫酸氫鈉限制性內切酶分析法（COBRA）等，這些方法各有優勢，但是均存在諸如實驗設計復雜，易產生假陰性或假陽性等問題，提示科學家尋找更加容易且準確的分析手段。
甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）是近年興起的一種適用于評估特定基因DNA甲基化的新技術[4]。它基于當前實時熒光PCR儀器的前沿應用 – 高分辨率熔解曲線分析（HRM），使用既可擴增甲基化序列也可擴增非甲基化序列的引物對來自經重亞硫酸鹽修飾的DNA的相關區進行PCR擴增。重亞硫酸鹽修飾DNA，讓非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不變，隨后通過PCR擴增檢測感興趣區域的甲基化狀態。在MS-HRM中，在飽和的DNA結合染料存在的情況下進行PCR反應，在擴增后進行高分辨熔解曲線分析，HRM分析的特點為可以區分擴增產物中少至1個堿基變化的序列差異，從而通過尿嘧啶/胞嘧啶的差異判斷擴增子來源于甲基化還是非甲基化的初始模板變異體。MS-HRM可評估引物之間整條擴增子的甲基化狀態。由于它是一種閉管方法，可初步快速評估甲基化。相比于傳統的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量靈活（zui多一次篩查384個樣本，zui少幾個樣本），并且準確率大大提升。結合標準品的特征熔解曲線，還可以對樣本中存在的甲基化DNA比率進行基本的定量。
更多有關特定CpG位點的甲基化的詳細信息，可采用重亞硫酸氫鹽修飾后測序分析。
我們使用羅氏診斷公司的LightCycler®480高分辨熔解擴增試劑盒在LightCycler®480實時熒光PCR儀上，通過MS-HRM測定法對兩種已知的經過啟動子（FANCE和MGMT）甲基化的DNA修復基因的檢測性能。
材料和方法
將多種細胞株的DNA樣本作為檢測模板。每μg的每種DNA樣本都經過重亞硫酸鹽修飾。通過在正常DNA（經過重亞硫酸鹽修飾）池中按50％、25％、10%、5％和1％稀釋100％的甲基化對照DNA（經過重亞硫酸鹽修飾）以創建甲基化標準品。MS-HRM引物按Wojdacz和Hansen描述的方法設計[5]。使用LightCycler®480高分辨熔解擴增試劑盒在96孔LightCycler®480儀器中執行擴增和熔解反應。

圖1：（a）含100％甲基化和非甲基化質控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標準品的FANCE MS-HRM測定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數據。（b）含100％甲基化和非甲基化質控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標準品的MGMT MS-HRM測定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數據。

圖2：（a）FANCF MS-HRM測定，顯示稀釋卵巢癌細胞株2008中存在DNA甲基化。（b）MGMT MS-HRM測定，顯示乳腺癌細胞株MDA-MB435和HS578T中存在甲基化。

結果和討論:
針對兩個基因的MS-HRM測定法都可檢出非甲基化DNA背景下1％的甲基化DNA。圖1顯示MGMT的測定和FANCF測定相比，在該試驗使用的引物退火溫度（58℃）條件下可更加明確的識別稀釋比更低的甲基化標準品。圖2顯示使用FANCF和MGMT MS-HRM測定法篩查多種細胞株的甲基化狀態。圖2a顯示通過FANCF篩查的九種細胞株中只有卵巢癌細胞株2008存在甲基化，其樣本熔解特征曲線與100％的甲基化質控品相似。研究的其它細胞株通過FANCF檢測為非甲基化結果。圖2b顯示通過MGMT檢測出乳腺癌細胞株MDA-MB435存在甲基化。該樣本的曲線特征再次與100％的甲基化質控品相似。HS578T乳腺癌細胞株非常有趣，因為它的熔解曲線與非甲基化和甲基化曲線都不同。該曲線以檢測區出現異質性甲基化為特征。
LightCycler® 480實時熒光PCR儀是一款非常適合進行HRM的實時熒光PCR儀器，配合使用LightCycler® 480高分辨熔解擴增試劑盒，即成為了一套執行甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）檢測的可靠平臺，允許快速高通量研究DNA甲基化。相信這個新的研究方法的推出可以有效加快表觀遺傳學的研究進程，做到更快、更準、更好。