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電轉化連接物及構建抗體文庫
閱讀：1088 發布時間：2010-11-29[器材和試劑]
●電感受態大腸桿菌TG1（
●37℃孵育箱（NewBrunswick）
●電轉化儀及0．2cm間距小杯（GenePulserTM Biorad）
●16℃水浴
●SOC培養基（將20g細菌培養用胰蛋白胨、5g酵母提取物及0．5g NaCl溶于950ml水中。加入10m1 250mmol/L
KCl，5mol/L NaOH調整pH至7．0并加入去離子水至IL。高壓滅菌。手感變涼后，再加入5ml 2mol/L MgCl2
和20ml lmol/L葡萄糖）
●100mm和150mm含100ug/m1氨芐青霉素和2%葡萄糖的TYE平板（TYE/amp/glu）（將16g細菌培養用胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g細菌培養用瓊脂加入到去離子水中并調整體積至IL。高壓滅菌。當溶液乎感變涼時，加入氨芐青霉素和葡萄糖并倒板）
●含100ug/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的2×TY培養基（2×TY/amp/glu）
●50%甘油
[方法]
1．將電轉化儀設置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。
2．在冰上復溶電感受態細菌或使用新鮮制備的電感受態細胞。將電轉化杯、杯固定夾、細胞和DNA均放于冰上。
3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。
4．將混合物轉移至0．2cm間距的電轉化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉移以使小杯處于低溫狀態。
5．將透明杯放入電轉化儀內，確保小杯側面干燥（以免電弧）。啟動脈沖，立即加入1．0ml SOC培養基并混合。時間恒定值應在4．5～5．5毫秒范圍之間。如果時間恒定值小于4．3秒，則重復DNA沉淀。
6．在每次電轉化后的細菌中加入lmlSOC培養基，以250r/min振蕩培養，37℃1小時。
7．合并所有電轉化培養液，系列稀釋后在100mm TYE/amp/glu平板上鋪板確定文庫容量。
8．以200g、4℃10分鐘離心剩余的細菌培養液。將每4次電轉化的沉淀重懸于500u1的體積。以每份125ul等量體積分別鋪于150mmTYE/amp/glu平板上或將500ul鋪于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm2。將這些平板在30℃下培養過夜。
9．加入10m1含15%甘油（0．2gm濾膜過濾除菌）的TYE/amp/glu培養基；刮取平板上的細菌。在-70℃下儲存抗體文庫