化工儀器網
技術文章
般注意事項：
閱讀：410 發布時間：2010-12-9- 當PCR結果不甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執行：
- 將PCR反應的試管與反應板緊貼。
- 當酶反應混合物以70℃“熱啟動”開始循環時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
- 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統的因素，必須與其它成份保持平衡。
- 對于有問題的PCR反應，例如模板的量少，模板不純和環狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預變性，后加模板進行正常PCR擴增。
- 沒有擴增產物：
- 在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
- 泳道中出現模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應中可能缺少游離的Mg2+。
- 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
- 檢查模板和引物的用量。
- 增加循環次數和/或模板DNA的用量。
- 泳道中出現模糊條帶：
- 減少循環次數或模板DNA的用量。
- 提高退火溫度，但不要超過68℃。
- 重新設計引物或設計更長的引物。
- 其他值得注意的條件：
- 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。
- *反應體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。
- 大多數反應中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數情況下可以得到滿意的結果。
- 建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到*結果，優化Mg2+的濃度是必需的。
- 基因組DNA模板的質量顯著影響PCR反應。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統的基因組DNA能擴增片段至10kb。
- 要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關文獻。
- 降低二級結構和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應的退火溫度來增加反應的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優先擴增的影響。
- 變性：*步變性在94℃下進行2分鐘。在循環過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應該盡可能的降低變性溫度。
- 延伸：68--72℃下進行延伸操作。
- 循環延伸：盡量采用循環延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。
- 長片斷PCR系統擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產物補平后再進行。
- 測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產生均一的（染色體）帶型。
- 引物設計：
- 一般長度20-30bp；
- 至少50%的GC含量；
- 避免引物二聚體和二級結構；
- 引物對的Tm值應該接近。
也可下列圖示提示找到解決問題的突破口：
