膠體金標記試劑的檢測
膠體金粒子在pH值接近蛋白質的pI時,二者容易形成牢固的結合物。膠體金粒子可以廣泛地與抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、鏈霉親合素等結合。由于結合的蛋白可與金粒子緩慢地分離,因此,膠體金試劑在使用前應該通過洗滌去除游離蛋白。
金標記zui初用于電子顯微鏡研究,但亦可用于光學顯微鏡,得到比酶標記方法較高的分辨率,而且,可避免底物的準備及內源性酶活性干擾等問題。金標記在光學顯微鏡水平雖缺乏敏感性,但應用光化銀增強顯影方法克服了這一問題。
非擴大的金標記可直接用于光學顯微鏡檢測,在明視野下,依據反應強度的不同,標記范圍從淡粉色到深紅色,Nomarski不同的干擾與光學顯微鏡形成對照,使標記物呈現深紅色到黑色。使用銀增強方法,金粒子由金屬銀包被形成一種黑褐色標記物,通過明視野極易觀測。膠體金標記方法可與許多組織化學染色方法相配合。金標記反應亦很容易控制,因為染色的呈現過程可在光學顯微鏡下直接監測,并可有控制地繼續進行。
1.需要的溶液和特殊設備
0.5mol/L的枸櫞酸鈉(pH3.5) 5.6%羥苯醌(避光保存);
0.73%乳酸銀(避光保存);
1%乙酸
標準的固定液。
檢測用的暗室,光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2.操作步驟
(1)在蒸餾水中短暫地漂洗標本片,標本片可以在染色后直接檢測或者用銀增強處理后觀察,用Gelvattol或者Mowiol封片;
(2)銀增強方法,轉移樣本到暗室中。檢測劑的準備:混合2份0.5mol/L枸櫞酸鈉(pH3.5),3份5.6%羥苯醌和12份水。使用前再直接加3份0.73%乳酸銀;
(3)將金標記物處理的標本片浸泡于此檢測液中,室溫孵育2~3min;
(4)用1%乙酸短暫地漂洗,并在標準攝影固定液中固定數分鐘;
(5)優化:如果需要,進行復染;
(6)樣品用DPX封片。