化工儀器網
技術文章
真核細胞基因組提取
閱讀：734 發布時間：2012-3-24一. 實驗目的及背景
高等動物，高等植物的基因組相當龐大， 如人類細胞基因組由30億個堿基對組成，果蠅基因組有1.4×108個堿基對，水稻基因組有1.4×109個堿基對。真核細胞基因組中，約1萬－1.5萬個可表達的結構基因，其它大量存在的是調控序列和內含子序列。可以說某特定物種的基因組，包含了該物種生長，發育，繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細胞基因組的結構，組成，以及表達調控的研究是至關重要的，而研究的起點就是要獲得純度高--不含蛋白質、糖類、酚、氯仿等污染；得率好--以便有足夠量用于分析；基因組相對完整--斷裂的基因組以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文庫的構建，基因探測等的研究。
真核細胞基因組在提取過程中一般有以下幾步，首先是機械法破細胞抽提；然后去除蛋白質，糖類等細胞內雜質污染；zui后純化出DNA，由于真核細胞基因組較大，在操作中應注意動作輕柔，且在低溫下進行，以zui大限度地減少機械和化學作用對DNA的剪切，從而獲得相對完整的DNA。
二．實驗試劑及材料
材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。
試劑：液氮
CTAB抽提緩沖液：2%CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基*基溴化銨） ，1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿：異戊醇（24:1）
異丙醇 70％乙醇TE buffer
三．實驗方法
1．取0.5g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干。
2．植物材料剪成1cm左右碎片，放入預冷的瓷研缽中。
3．加入液氮速冷，研磨成細粉（越細越好）。
4．在5ml離心管中加入抽提緩沖液2.5ml，60℃保溫1小時。
5. 15000rpm，離心10分鐘。上清轉入另一個新的離心管中。
6．加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），混勻抽提至水乳膠融狀。
7. 15000rpm，離心10分鐘。
8．上清轉入另一個新的離心管中。
9．加入2/3倍體積預冷異丙醇，-20℃保溫30min―1hr，緩緩混勻DNA成絮狀折出。
10．15000rpm，離心10分鐘，棄上清。
11．DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。
12．加入400μl TE buffer溶解DNA。