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亞適劑量抗IsM抗體刺激B細胞增殖法檢測IL-4
閱讀：627 發布時間：2012-6-9亞適劑量抗IgM抗體對B淋巴細胞的刺激較弱，當加人IL-4時，B淋巴細胞對亞適劑量抗IgM抗體刺激表現出明顯的DNA合成增加，3H-TdR摻人量與IL-4含量相關。
（1）小鼠脾臟B細胞懸液的制備
1）取BALB／c或C57BL／6小鼠，常規方法分離脾臟淋巴細胞。用Hanks液洗2次；再用10％NBS-IMDM培養液調整細胞濃度為1X107～2X107／mL。
2）去除粘附細胞：將上述脾細胞懸液置24孔培養板，每孔1～1．5mL，置37cC，5％C02溫箱中培養1h；將細胞懸液移至另外培養孔內，繼續培養1h，收集非粘附脾細胞；亦可通過SephadexG-10柱去除粘附細胞。
3）去除T細胞：調整細胞濃度至5X107／mL，按1：40（V／V）加入抗小鼠T細胞血清或抗Thy-1，2McAb，置4~C 30min后，按1：15（V／V）加入新鮮豚鼠混合血清，充分混勻后溫育1h；離心棄上清，用無血清培養液懸浮細胞。此時T細胞已死亡破碎，通過淋巴細胞分層液，低速離心予以去除。
4）B細胞的相對純化：用淋巴細胞分層液500—800r／min離心6—8min，將上述細胞懸液再次純化；用Hanks液洗1—2次，調整細胞濃度至1X106—2X106／mL。
（2）誘生上清IL-4含量的測定
1）將上述B細胞懸液加入96孔培養板，100~tL／孔，分別加入待測IL-4誘生上清或不同量標準品rlL-4，其濃度為每毫升0．5U、1U、2U、3U、4U、5U、6U，各組均設3復孔。
2）加亞適劑量抗IgM抗體，一般終濃度0．5％（V／V）為抗IgM的亞適劑量，也可在實驗前自行測定。
3）常規培養48～72h，結束前8-16h加入3H-TdR，收獲細胞測定cpm值；以標準品cpm值繪制標準曲線，從標準曲線上查出IL-4活性。
（3）注意事項
1）B細胞純度直接影響結果，B細胞懸液中若含有T細胞或死亡T細胞及其碎片，可影響試驗結果。因此有人主張用Percoll不連續密度梯度離心，去除死細胞及碎片，可得到較高純度的B細胞懸液。
2）純化B細胞懸液時，應盡量縮短操作時間，減少不利因素，保證細胞活力，使實驗結果較穩定，重現性好。
3）誘生細胞上清收獲時間必須控制在30h左右。時間過長，上清中IL-4含量會降低。