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質體的轉形與重組質體的檢定
閱讀：689 發布時間：2010-7-5細菌質體需藉由轉形 （transformation） 的技術，將的引介入細菌體中，藉由寄主細菌的系統?達成復制或進?基因表現的目的。寄主細菌的選擇，須視質體的種類及實驗的目的而定。本實驗的目的在建構一個表現質體，使的能在大腸桿菌中大?表現 GUS。
然而，?用大腸桿菌進?外源基因的表現時，常遇到的問題是，外源基因的產物會對寄主細菌造成傷害；此外，持續?斷的表現外源基因也會使寄主細菌生長減慢或無法生長。因此，必須有適當的調控機制?控制外源基因的表現。 我們所用的載體pQE31 在T5 promoter與外源基因插入地址的間，具有一段lac operon中的lacO序?，可?用lac repressor結合其上?調控T5 promoter的啟動，只有在inducer （?如IPTG） 加入時，才會啟動轉錄的進?，而lac repressor的?源則必須靠寄主提供。由于此質體為multiple copies，一般大腸桿菌菌株中lac repressor的含??足以有效地進?調控，縱使未加入inducer，也會有外源蛋白質的表現，萬一外源蛋白質對寄主造成毒害，使的無法生長，我們可能?表現質體?無法選殖到，?無法達成我們的實驗目的?。 我們所選用的寄主菌株JM109 所具有的 lacIq，能夠過?表現 （overproduce） lac repressor，因此可較有效地控制T5 promoter的啟動。 然而，?是?JM109 這一類帶有lacIq的菌株?發生問題時，就必須再?換其它的寄主菌株；?如M15[pREP4]，此菌株除?染色體上的lacI基因外，還帶有能持續表現lacrepressor的質體，應可解決lac repressor ??足的問題。
檢定載體上是否接上外?的DNA 片段，常因質體?同而有?同方法，一般常?用外?DNA 片段的插入導致載體某表現形的喪失 （insertional inactivation） ?作為篩選的依據；或者可?用插入的DNA 上帶有宿主所缺少的表現型進?篩選。?載體與插入DNA 皆無適當的篩選依據，則可將菌?中的質體抽出后，以限制酶作用后進?電泳分析。而我們實驗中所用的質體pQE31，并沒有簡?快速篩選重組質體的方法可用，因此需要?用GUS 的抗體進?colony hybridization，尋找可表現出GUS的轉形株；或在培養基中加入GUS 的基質，轉形株?可表現出GUS，則可將基質分解使菌?呈現藍色；或以質體快速抽取法，篩選帶有正確分子?質體的轉形株。 三種方法?請練習，得到的正反應株均必須再抽取質體進?限制酶分析，以進一步確認質體的正確性。