凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的空隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可自由地進出凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內擴散到膠粒孔隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。
對生物樣品來說，經常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開，如蛋白質與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。
1）類分離
目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質，并不要求分離分子量相近的組分。
2）分級分離
目的是分開分子量不是很懸殊的大分子物質。選擇凝膠型號時必須使各種物質的Kd(分離系數)值盡可能相差大一些。
層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。
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