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丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法

貨號：BC0385

規格：100T/96S

產品內容：

試劑一：110mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：1mL×1支，-20℃避光保存；

試劑三：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水；

試劑七：粉劑×1支，4℃保存；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、0.5mL六、七轉移到試劑三中混合溶解待用。

產品說明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環連接起來。

    PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致605nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品

    可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、PDH的提取

    準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

• 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長605nm，蒸餾水調零。
• 每個樣本需要180μL工作液，按樣本數取出一定量的工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min。
• 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA_空白=A1-A2。
• 測定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A3和 1min后的吸光值A4，計算ΔA_測定=A3-A4。
•  

三、PDH活性計算

a.用微量比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=1827.62×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=3.655×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，21×10³mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

注意事項：

1、測定過程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。

丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法訂購說明：

1、絕大部分產品備有現貨，一般情況下都能訂貨當日發貨。 
2、部分非常用產品，需提前1－2日預訂，海外期貨則需要提前3-6周預訂。 
3、部分產品價格會因貨期、批次等因素發生變化，若有變動以訂貨當日新價格為準。 
4、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整，因超過截止時間造成當日不能發貨的將于次日安排發貨。
5、請辦理完貨款后，將底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運輸說明：

極低溫產品：極低溫產品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
低溫產品：低溫產品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產品的性質穩定如一，為您的實驗保駕護航。
常溫產品：常溫產品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產品由公司庫房人員快速配貨，準確快速高效的快遞保證產品快速送達您的手中。