首頁 >> 供求商機
α-酮戊二酸脫氫酶活性測定試劑盒 三羧酸循
貨號：BC0710
規格：50T/48S
產品內容：
試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體0.6mL×1支，-20℃保存；
試劑三：液體55mL×1瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1支，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑八：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加入2mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。
工作液的配制：臨用前把試劑四、試劑五、試劑六、試劑七轉移到試劑三中混合溶解待用。
產品說明：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中，是三羧酸循環調控關鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、α-KGDH的提取
稱取約0.1g組織或收集約500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑二，冰浴用勻漿器或研缽充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長到340 nm，蒸餾水調零
2. 空白管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL試劑八和60μL蒸餾水，混勻并立即測量340nm處0s的吸光值A1，37℃準確反應2min，記錄340nm處2min時的吸光值A2，計算ΔA空白=A2-A1。
3.測定管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL試劑八和60μL樣本，混勻并立即測量340nm處0s的吸光值A3，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中準確反應2min，記錄340nm處2min時的吸光值A4，計算ΔA測定=A4-A3。
三、α-KGDH活性計算
1.按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=1473.7×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr
2.按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1488.5×(ΔA測定-ΔA空白)÷W
3. 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性（U/104cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=2.977×(ΔA測定-ΔA空白)
V反總：反應體系總體積，1.1×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。
注意事項：
1、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。
α-酮戊二酸脫氫酶活性測定試劑盒 三羧酸循
16