外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，是細胞間信號傳輸的載體。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，參與細胞間通訊。近年來，外泌體的研究熱度持續攀升，在2019年國家自然科學基金獲批項目中，外泌體研究相關項目的總數突破500個，立項的總金額突破2億元。但由于外泌體的尺寸（30~200 nm），常規的光學顯微鏡無法對其進行成像分析，因此很少有技術能夠對單個外泌體進行物理表征和蛋白分型。

美國NanoView Biosciences公司推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView，系統采用了創新的SP-IRIS成像技術，只需要少量樣品即可一次完成外泌體計數、粒徑、蛋白表達、蛋白共定位、亞群分布的分析。全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，目前在全球已近100多個實驗室采用該技術，發表文獻超過170篇。進入2022年，使用ExoView發表的論文出現井噴性增長，短短數月已經發表了超過75篇。本文選取了兩篇在高水平期刊《Nano Letters》發表的比較有代表性的文章，來說明ExoView在間充質干細胞（MSC）、單外泌體亞群分析等研究領域的具體應用。

三維培養的MSC外泌體-水凝膠混合微針陣列貼片用于脊髓修復

脊髓損傷（SCI）是脊柱損傷最嚴重的并發癥，是人類健康最嚴重的威脅之一。早先研究已證明間充質干細胞(MSC)來源的外泌體在SCI治療中方面具有巨大的應用潛力。然而，傳統的二維（2D）培養模式會導致間充質干細胞的干細胞特性喪失，從而影響間充質干細胞來源的外泌體（2D-Exo）的治療性能。三維培養模式產生的外泌體（3D-Exo）具有更高的治療效率，因此其在脊髓治療中也有著更為廣泛的應用，但之前的相關報道極少。另外，傳統的外泌體治療通常依賴于局部的反復注射，遺憾的是這種方法由于清除速率很快導致治療效率低下，并且也可能會導致對脊髓的二次損傷。因此，開發一種更加可靠、方便和有效的外泌體遞送方法，以實現穩定的原位外泌體釋放成為新的研究方向。近日，韓敏等^[1]開發了一種可控的3D外泌體水凝膠混合微針陣列貼片以實現SCI原位修復。

其中，研究人員使用甲基丙烯酰化明膠（GelMA）混合3D培養的MSC來源的外泌體構建了用于微針陣列貼片，并用ExoView對2D-Exo和3D-Exo進行了檢測。2D-Exo和3D-Exo的亞群計數結果顯示，具有CD81+或（和）CD9+跨膜蛋白的外泌體數量最多（圖1 A和B）。2D-Exo和3D-Exo的熒光強度分布如圖1 C和D所示。熒光共定位分析結果顯示3D-Exo富含同時表達CD81+CD9+的外泌體（圖1 E、F、G、H）。此外，MSC-Exo粒徑的統計分析表明，2D-Exo的CD9+外泌體的平均粒徑為67±22nm，2D-Exo的CD81+外泌體的平均粒徑為70±25nm（圖1 I和J），3D-Exo的CD9+外泌體的平均粒徑為60±15nm，3D-Exo的CD81+外泌體的平均粒徑為59±14 nm（圖1 K和L）。總體而言，3D-Exo粒徑更小，更容易被靶細胞吞噬。熒光成像結果顯示，3D-Exo中CD81和CD9的熒光強度顯著高于2D-Exo（圖1 M和N )。

圖1     ExoView檢測2D-Exo和3D-Exo的亞群數量、熒光強度、共定位、粒徑分布以及進行熒光成像

超靈敏的高通量液滴數字酶聯免疫吸附法檢測單外泌體

由于外泌體在診斷和治療領域具有巨大潛力，因此單外泌體水平檢測一直是研究熱點。目前大多數的外泌體分析技術主要基于成像，但是較多成像技術檢測的粒子數量級有限，很難實現臨床樣本的高通量檢測（大于108 EV/ml）。此外，單一平臺實現檢測靈敏度達到單外泌體水平、區分外泌體的不同亞群特異性以及高通量分析非常具有挑戰性。近期Zijian Yang等^[2]發明了一種高通量數字測定法，這是一種基于液滴可以對特定的單外泌體亞群進行高通量量化分析的光流控平臺（DEVA）。

其中，研究人員使用ExoView對來源于人類神經元的外泌體進行分析，對開發的DEVA系統進行評估。ExoView可以通過免疫捕獲和熒光標記對外泌體進行分析，紅色熒光抗體代表CD63，綠色熒光抗體代表CD81，藍色熒光抗體代表CD9（圖2 A和B）。亞群計數結果顯示CD81+外泌體數量顯著高于CD63+或CD9+外泌體（p<0.05，p<0.0001），也顯著高于MIgG陰性對照（p<0.0001)（圖2 C）。CD81+外泌體的熒光共定位分析顯示每個標記組代表一個不同的外泌體亞群，互相沒有交集，其中只標記CD81熒光抗體的外泌體數量最多，其次是只標記CD63熒光抗體和同時標記CD63CD81熒光抗體的外泌體（圖2 D）。另外，在CD81+外泌體中，67% (64.3%-69.8%) 的外泌體同時共表達了另一個CD81蛋白（熒光標記）（圖2 E）。因此，研究人員選擇使用CD81進行捕獲和標記，而不是使用神經元特定的表面蛋白標記物，這樣能夠量化和校準DEVA的性能。

圖2 ExoView的原理示意圖以及ExoView檢測人類神經元的外泌體的亞群數量、共定位和進行熒光成像

在上述兩篇文章中，科學家借助美國NanoView Biosciences公司研發的全自動外泌體熒光檢測分析系統ExoView，直接檢測樣本中的外泌體，無需純化，操作簡單。一次結果直接輸出外泌體粒徑，絕對數目，蛋白表型，不同亞群的含量、多色熒光成像圖。兩篇文章分別從間充質干細胞（MSC）、單外泌體亞群分析等研究領域介紹了ExoView的無需純化，全面表征的特點，有力地證明ExoView是外泌體檢測的一大利器。

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參考文獻：

[1]  Min   Han ……& Tao Xin. (2022) Three-Dimensional-Cultured MSC-Derived Exosome-Hydrogel   Hybrid Microneedle Array Patch for Spinal Cord Repair. Nano Letters, 22, 15: 6391–6401.

[2]  Zijian   Yang ……& David A. Issadore. (2022) Ultrasensitive Single Extracellular Vesicle   Detection Using High Throughput Droplet Digital Enzyme-Linked Immunosorbent   Assay. Nano Letters, 22, 11: 4315–4324.

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