神經HRP示蹤顯色液(TMB法)說明書

 上個世紀 70 年代，Kristensopn 和 Olsson 報道了HRP可神經末梢攝取，經軸漿逆行運輸至神經元胞體，經組織化學方法可顯示出神經元的輪廓，從而開發出 HRP  追蹤神經元示蹤技術，即為 HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)是非常優越的酶免試驗顯色劑，能溶解于多種有機溶劑和雙蒸水中，為穩定的無色溶液，不適量過氧化脲或雙氧水不緩沖液混   勻后，不過氧化物酶作用產生清晰的藍色產物，極易觀察，在辣根過氧化物酶的催化下 , TMB 會產生藍色沉淀，該沉淀不溶于水和乙醇，顯色后呈藍色，可在顯微鏡下觀察。

神經 HRP 示蹤顯色液(TMB 法)是動物經麻醉、注入HRP后，游離或絡合型的 HRP 不氧化劑反應生成絡合物，該絡合物氧化供氫的 TMB 顯色劑，呈藍色，在顯微鏡下清晰可見，該檢測法較 DAB  法靈敏。該顯色液僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

(一)、準備工作

1、動物麻醉：多用(3.5%)戊巴比托妥鈉作為麻醉劑，大鼠的麻醉劑量為 0.25-0.35ml/100g。

2、導入HRP：有壓力注射法、電泳法以及周圍神經系統的注射涂抹等法。

3、確定動物存活期。

4、動物灌注：麻醉后，經左心室升主動脈插管行心內灌注固定。先用生理鹽水或 PBS 快速灌注。隨后用 4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，時間控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)。

5、取材：取組織置于 20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中，切片厚度 40μm，存于蔗糖磷酸鹽緩沖液備用。

(二)、顯色反應

1、配制 TMB孵育液：取適量的TMB assay buffer 和TMB顯色液，按 TMB assay buffer： TMB顯色液=39:1 的比例混合，即為 TMB孵育液，即配即用，不宜保存。

2、配制TMB顯色工作液：取適量的TMB孵育液和TMB增強劑，按TMB孵育液：TMB 增強劑=2000～8000：1 的比例混合(具體比例應根據具體時間摸索確定)，即為TMB顯色工作液，即配即用，不宜保存。

3、配制 1×TMB Wash buffer：取適量的TMB Wash buffer(20×)，按TMB Wash buffer： 蒸餾水=1:19 的比例混合，即為 1×TMB Wash buffer。室溫保存6個月有效。

4、切片用蒸餾水清洗 3 次，每次 2min。

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育)，避光孵育20min，其間不斷晃動。

6、切片入10ml TMB 顯色工作液(提前 20℃溫育)，避光孵育 20min，其間不斷晃動。7、漂洗：取10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次，每次 5min。

8、貼片，載玻片用鉻明礬明膠包被，室溫空氣干燥。

9、脫水、透明步驟按如下操作：

 ①蒸餾水 10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次，每次 10s

⑤二甲苯2次，每次 2～5min。

1. 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察藍色反應。

注意事項：

1、如果出現高的反應背景或沉淀，表明TMB底物反應過于強烈。

2、所用器皿必須潔凈，避免含有氧化劑或還原劑，否則會產生非特異性反應。

3、TMB顯色液避免反復凍融，以免顯色效率下降。

4、TMB增強劑注意密閉保存，否則顯色效率下降。

有效期： 12 個月內有效。