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技術文章

撫生試劑-核酸擴增工藝的優化和質量控制工藝優化

閱讀:133          發布時間:2014-4-11

核酸擴增工藝的優化和質量控制工藝優化
  核酸擴增工藝在整個核酸檢測試劑中zui重要,其涉及的試劑及原材料多,反應參數設定復雜,是整個檢測反應的核心。具體包括檢測試劑的配制與反應參數的設置。其中檢測試劑主要由以下組分組成:引物、探針、Taq酶、UNG酶等;反應參數包括引物與探針濃度、*Tm值、信號采集溫度等。以HIV-1熒光定量PCR檢測試劑為例進行說明。

工藝優化

1.引物探針的設計與優化

引物探針的設計與質量控制見前面*節,根據保守的靶序列,按照HIV引物探針設計的要求設計幾對引物和探針,從中進行優化選擇。

將這幾對引物及探針系統經過網上數據庫比對,顯示須為HIV-1特異序列。對HIV全基因組克隆質粒系列稀釋物進行檢測,能夠檢測到10個分子/PCR反應引物探針系統為待選的引物探針系統。將待選的引物探針系統對臨床血清樣本進行檢測,應具有較好的特異性與敏感性,同時應對HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸檢測無交叉反應。

2.反應參數的優化

將HIV靶序列RT-PCR產物克隆到T載體上,酶切線形化后稀釋成不同濃度的樣本,從引物濃度、熒光探針濃度和PCR循環參數幾個方面進行反應參數的選定。

1)反應參數的確定:根據引物Tm值、產物大小在梯度PCR儀上進行不同延伸溫度的測定,根據zui適的延伸溫度確定*熒光信號采集溫度。

2)引物、探針濃度的確定:不同濃度引物、探針組合后對系列稀釋的病毒RNA檢測,以確定zui適的引物、探針濃度。

3.防污染的優化

擴增的產物污染引致的PCR假陽性是PCR實驗污染的主要來源,可用UNG-dUTP系統有效去除,具體過程為:擴增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP),故產物中含尿嘧啶核苷(du)后續擴增之前,在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG),在預變性加熱時,若體系中存在前一次擴增產物的污染,污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂,不可能作為下一次擴增的模板,從而達到消除污染的目的。

 

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