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撫生試劑-核酸擴增工藝的優化和質量控制工藝優化
閱讀：133 發布時間：2014-4-11核酸擴增工藝的優化和質量控制工藝優化
核酸擴增工藝在整個核酸檢測試劑中zui重要，其涉及的試劑及原材料多，反應參數設定復雜，是整個檢測反應的核心。具體包括檢測試劑的配制與反應參數的設置。其中檢測試劑主要由以下組分組成：引物、探針、Taq酶、UNG酶等；反應參數包括引物與探針濃度、*Tm值、信號采集溫度等。以HIV-1熒光定量PCR檢測試劑為例進行說明。
工藝優化
1．引物探針的設計與優化
引物探針的設計與質量控制見前面*節，根據保守的靶序列，按照HIV引物探針設計的要求設計幾對引物和探針，從中進行優化選擇。
將這幾對引物及探針系統經過網上數據庫比對，顯示須為HIV-1特異序列。對HIV全基因組克隆質粒系列稀釋物進行檢測，能夠檢測到10個分子/PCR反應引物探針系統為待選的引物探針系統。將待選的引物探針系統對臨床血清樣本進行檢測，應具有較好的特異性與敏感性，同時應對HAV、HBV、HCV及DFV等的核酸檢測無交叉反應。
2．反應參數的優化
將HIV靶序列RT-PCR產物克隆到T載體上，酶切線形化后稀釋成不同濃度的樣本，從引物濃度、熒光探針濃度和PCR循環參數幾個方面進行反應參數的選定。
1)反應參數的確定：根據引物Tm值、產物大小在梯度PCR儀上進行不同延伸溫度的測定，根據zui適的延伸溫度確定*熒光信號采集溫度。
2)引物、探針濃度的確定：不同濃度引物、探針組合后對系列稀釋的病毒RNA檢測，以確定zui適的引物、探針濃度。
3．防污染的優化
擴增的產物污染引致的PCR假陽性是PCR實驗污染的主要來源，可用UNG-dUTP系統有效去除，具體過程為：擴增底物中以脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脫氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP)，故產物中含尿嘧啶核苷(du)后續擴增之前，在PCR體系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG)，在預變性加熱時，若體系中存在前一次擴增產物的污染，污染物中所有的dU處均被UNG酶解斷裂，不可能作為下一次擴增的模板，從而達到消除污染的目的。