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撫生試劑-小鼠脾細胞和小鼠的骨髓瘤細胞融合
閱讀：535 發(fā)布時間：2014-6-241單抗技術(shù)的理論依據(jù)
單抗技術(shù)的基本原理為：小鼠骨髓瘤細胞能在體內(nèi)外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細胞具有產(chǎn)生抗體的能力，但不能無限增殖。采用融合劑（PEG等）將這兩種細胞融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有親代細胞的主要特怔。既能在人工培養(yǎng)下無限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體。
淋巴雜交瘤技術(shù)是單抗技術(shù)的重要理論依據(jù)。在前文中已經(jīng)述及。Kohler和Milstein將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細胞與經(jīng)綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病毒介導(dǎo)，雜交細胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里，盡管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親本骨髓瘤細胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。象這種用被抗原免疫過的脾細胞和骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤的技術(shù)就是雜交瘤技術(shù)。
上述作為融合劑的仙臺病毒在后來的實驗過程中被聚乙二醇（PEG）代替。因為聚乙二醇的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題。
然而雜交瘤技術(shù)的誕生也是免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了技術(shù)貯備。
2 單抗的制備的基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是適合國內(nèi)大多數(shù)實驗室操作的程序。
在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、高壓鍋、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等。