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士鋒生物Western blot實驗和檢測大量蛋白方法
點擊次數：935 發布時間：2013-9-9
這種稱為“micro-western arrays”（微印跡分析，譯）的方法能將蛋白檢測常用實驗：Western blot的特異識別能力，和DNA芯片檢測的高通量能力結合起來，幫助科學家們一次實驗就可以觀測到細胞中各種蛋白之間的網絡系統，節省了每次反復實驗的人力和物力。
領導這一研究的芝加哥大學癌癥生物研究所資深研究員Richard B. Jones表示，“蛋白才是細胞中真正的行使功能的‘儀器’，但是由于這一系統太復雜，所以還沒有科學家能深度剖析它們，現在我們終于能利用這一技術分析蛋白了。”
自上個世紀70年代以來，實驗室就開始利用Western blot方法來檢測蛋白，這種方法又稱為免疫印跡，是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測，對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。Western blot方法由于蛋白是以非共價鍵形式吸附在固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，因此能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變，從而被廣泛的用于檢測蛋白水平的表達。
這一方法導致了細胞生物學領域大量成果的涌現，但是仍然受限于WB實驗需要大量細胞原料和昂貴的抗體，而且這一方法也不能同時進行多個蛋白的檢測。隨著細胞網絡中成百上千的蛋白被發現，科學家們越來越希望能分析這些蛋白的活動，和蛋白之間的相互作用。
正如Jones博士說的那樣，“當你走進一間黑暗的房間，如果不能獲得許多信息，那么很難去預測將會發生什么”，“如果有人點亮了燈，那么我們就不會再磕碰到物體了。”
Micro-western arrays（MWA）技術就是這樣的一盞燈，這種方法將芯片技術這種單個實驗就能檢測出上千基因的工具運用到蛋白上，利用預制的micro-western膠（包含96個微膠（miniature，譯）），幫助科學家們同時比較數以百計的蛋白表達，或者一次性比較不同治療條件下蛋白的情況。而且這種方法只需要納升級細胞原料和抗體，減少了實驗成本，也zui大化了單個樣品實驗能獲得的信息。
這種MWA方法具體步驟見下圖，研究人員為了能結合微型Western Blots方法和微孔板液體操作方法，首先通過一種96孔板大小的96塊統一的非接觸芯片膠來預印細胞裂解物，這樣6中不同的細胞裂解物也許就能通過96個不同的抗體進行檢測，或者24個不同的裂解物通過24個不同的抗體進行檢測。為了增加大分子蛋白的轉膜率，以及降低小分子蛋白的轉膜率，研究人員使用了醋酸鹽緩沖液來跑膠。每個蛋白點，每次在膠統一位置加6nl樣品，反復10次，這比一次放置60nl，蛋白點密度更大，信號更好。在印跡上樣品后，研究人員將這些樣品進行半干式蛋白電泳（semidry electrophoresis），12分鐘后轉至NC膜，進行掃描檢測。
這種高通量分析技術，結合了蛋白芯片分析，將納升級的樣品點在膠上進行電泳，從而可以不同分子量的蛋白進行分離，因此效果與傳統的Western Blotting一樣好，但是時間可以大大縮短，包含transfer、blocking、washing、2nd antibody需要2天，數據分析約需要2-3天，整個過程大約1周的時間，比傳統Western Blotting快48倍。這種新的技術，可以用極少量的樣品和抗體分析大量數目不同蛋白的變化，極適合研究干細胞、癌細胞、組織發育等過程中信號傳導路徑（signaling transduction pathway）的變化。
研究人員將MWA技術與傳統的Western Blot技術進行了比較，見下圖，左邊為傳統的WB方法，中間為MWA方法，研究人員利用200ng/ml的EGF刺激A431細胞，然后裂解細胞，獲得裂解物，一抗β-actin單克隆抗體鼠抗（IR800 （LI-COR）二抗檢測，綠色），和多克隆抗體兔抗（Alexa Fluor 680 二抗檢測，紅色）證明了兩者的檢測效果相當。右邊是熒光信號變化的折線圖。
研究人員也進行了驗證實驗，他們分析了一個癌細胞系中大量EGFR蛋白的情況，Jones博士說，“我們開始對這些之前從未有人進行的實驗進行驗證，這些實驗證明我們實際上同時能觀測120個靶標”。研究發現激活EGFR能同時激活幾種不同的細胞受體，這是一項新發現，解釋了為什么一些腫瘤能產生癌癥治療抗性。
Jones博士之前還曾合成超過500條含磷酸化酪氨酸的多肽，并且利用E. coli細菌分離數百個人類SH2- and PTB-位點包含蛋白，研究AR受體以及EGFR、MET和KIT的RTK受體被磷酸化酪氨酸后，與人類基因中含SH2-domain或PTB-domain上百個蛋白之間的相互作用。
隨著更多實驗的進行，這一方法未來也許能用于臨床癌癥和其它疾病更的診斷，或者用于直接個性化治療，臨床實驗受限于大多數的癌癥都是通過一種，或者兩種標記物進行檢測，這種方法容易出錯，利用MWA方法，Jones博士表示，“我們就能同時進行多種蛋白檢測，而不會僅僅局限于單個的猜想，這是之前從未能做到的。”
一些科學家也表示了對這種技術的看好，比如來自哥倫比亞大學生物醫藥信息學院的Andrea Califano就表示，“我認為這確實是一項技術突破，利用這種方法，我們就能更接近真實情況的模擬修飾后的信號蛋白，它們具有怎樣的活性，相互之間如何作用，這在目前的技術條件下是無法實現的”，“這打開了一扇了解細胞分子全貌的窗。”
來自都柏林大學的系統生物學主任Walter Kolch也認為，“系統生物學的zui大難題之一就是無法獲得高密度，實時性和高質量的數據，micro-western array方法也許能zui終解決這一問題”，“這是一個在傳統方法基礎上，運用新的idea得到一種新技術的好例子。”
原文摘要：
Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with micro-western arrays.
Nature Methods, January 24, 2010
實驗室簡介：
Dr. Richard Jones實驗室主要進行系統生物（system biology）和高通量（high-throughput）方式的研究，
主要研究范圍包含：（1）參與合成超過500條含phosphorylated tyrosine的peptide，并且利用E. coli細菌分離數百個人類SH2- and PTB-domain containing proteins，研究AR受體以及EGFR、MET和KIT之receptor tyrosine kinase（RTK）受體上之tyrosine被磷酸化（phosphorylation）后與人類基因中含SH2-domain或PTB-domain之百多個蛋白質可能之交互作用。
（2）參與研發新的高通量電泳分析技術（high-throughput western blotting）結合蛋白質微陣列點片機（protein array），將奈升（nano-litter）尺度的sample，點在膠上進行電泳分析。這種名為Micro-Western Array的技術可對不同分子量的蛋白質進行分離，因此效果和傳統的Western Blotting一樣好，但是時間可以大大縮短，整個過程大約1周的時間，比傳統Western Blotting快。這種新的技術，可以用極少量的sample和antibody分析大量數目不同蛋白質的變化，極適合研究干細胞、癌細胞、組織發育等過程中訊息傳導路徑（signaling transduction pathway）的變化。
未來Dr. Richard Jones實驗室將利用Micro-Western Array系統研究干細胞的分化（differentiation）、癌細胞周邊的血管增生（angiogenesis）、以及癌癥進展和惡化過程中訊號傳遞網路的改變。