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士鋒生物毛細管電泳的基本原理
點擊次數：777 發布時間：2013-10-9
毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近年來發展起來的一種分離、分析技術，它是凝膠電泳技術的發展，是液相色譜分析的補充。該技術可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析、快速、微量。
電泳遷移
不同分子所帶電荷性質、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質及PH的緩沖液或其它溶液內，受電場作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。
電泳遷移速度（v）可用下式表示：
v=uE
其中E為電場強度（E=V/L，V為電壓，L為毛細管總長度）。u為電泳淌度。
電滲遷移
電滲遷移指在電場作用下溶液相對于帶電管壁移動的現象。特殊結構的熔合硅毛細管管壁通常在水溶液中帶負電荷，在電壓作用下溶液整體向負極移動，形成電滲流。帶電微粒在毛細管內實際移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。
分離分析類型
根據其分離樣本的原理設計不同主要分為以下幾種類型：①毛細管區帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）;②毛細管等速電泳（capillary chromatography，CITP）;③毛細管膠速電動色譜（miceller electrokinetic capillary chromatography，MECC）;④毛細管凝膠電泳（capillary gelelectrophoresis，CGE）;⑤毛細管等電聚焦（capillary isoelectric focusing ，CIEF）。
毛細管區帶電泳（CZE）為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實驗條件包括緩沖液濃度、pH值、電壓、溫度、改性劑（乙腈、甲醇等），用于對帶電物質（藥物、蛋白質、肽類等）分離分析，對于中性物質無法實現分離。毛細管膠束電動色譜（MECC）為一種基于膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質分子在水相和膠束相分配的差異進行分離，拓寬了CZE的應用范圍，適合于中性物質的分離，亦可區別手性化合物，可用于氨基酸、肽類、小分子物質、手性物質、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細管等速電泳（CITP）采用先導電解質和后繼電解質，構成不連續緩沖體系，基于溶質的電泳淌度差異進行分離，常用于離子型物質（如有機酸），并因適用較大內徑的毛細管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細管等電聚焦電泳（CIEF）用于具兼性離子的樣品（蛋白質、肽類），等電點僅差0.001可分離的物質。毛細管凝膠電泳（CGE）依據大分子物質的分子量大小進行分離，主要用于蛋白質、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細管電色譜（CEC）及非水毛細管電泳（CNACE），用于水溶性差的物質和水中難進行反應的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來說明HPLC的原理。
CZE的基本原理
HPLC選用的毛細管一般內徑約為50μm（20～200μm），外徑為375μm，有效長度為50cm（7～100cm）。毛細管兩端分別浸入兩分開的緩沖液中，同時兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移，當分離樣品通過檢測器時，可對樣品進行分析處理。HPLC進樣一般采用電動力學進樣（低電壓）或流體力學進樣（壓力或抽吸）兩種方式。在毛細管電泳系統中，帶電溶質在電場作用下發生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象;電泳是指在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象。溶質的遷移速度由其所帶電荷數和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質、pH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細管壁形成有機雙層向負極移動，帶負電荷的組分被分配至毛細管近中區域，在電場作用下向正極移動。與此同時，緩沖液的電滲流向負極移動，其作用超過電泳，zui終導致帶正電荷、中性電荷、負電荷的組份依次通過檢測器。
MECC的基本原理
MECC是在CZE基礎上使用表面活性劑來充當膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質在水相、膠束相中的分配系數不同，在電場作用下，毛細管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時待分離物質在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術與色譜法的結合，適合同時分離分析中性和帶電的樣品分子。