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技術(shù)文章
如何對轉(zhuǎn)染細胞不表達進行補救
點擊次數(shù)：1124 發(fā)布時間：2013-10-17
問：
zui近做細胞轉(zhuǎn)染，預篩選穩(wěn)定克隆，載體為pEgfp-N1，pIERS
現(xiàn)在是平行做幾個基因，轉(zhuǎn)然后，只有空載體和一個基因可以看到綠色熒光，其余均沒有，這會是什么原因呢?怎么補救啊?
答：
需要考慮的問題有：
1.你的細胞和轉(zhuǎn)染的方法，是不是你的細胞本身就很難轉(zhuǎn)染，有些細胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染率很低的。在求助時告知細胞和具體的轉(zhuǎn)染方法和試劑。
2.質(zhì)粒的純度和質(zhì)量：看你使用那種試劑盒提取的，我們的經(jīng)驗是使用Qiagen比國產(chǎn)的一些試劑盒差別很大。
3.pEGFP-N1可用來表達融合蛋白，如果你插入的目的基因帶終止密碼子的話，這時候如果轉(zhuǎn)讓率很低的話沒有綠色熒光，只有空載有綠色熒光，但是在轉(zhuǎn)染293T時我們發(fā)現(xiàn)帶終止密碼子的載體還可以見到熒光，但比空載明顯弱許多，不像空載體一樣所有的細胞都帶GPF。所以，不知你克隆時目的基因是否帶有終止密碼，如果去掉終止密碼子也要注意是否發(fā)生移碼錯位。