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1.了解細(xì)胞

來(lái)自加拿大多倫多大學(xué)的Peter Zandstra實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)研究項(xiàng)目就是：通過(guò)從單層細(xì)胞懸浮液中收集人類(lèi)胚胎干細(xì)胞hESCs，提高h(yuǎn)ESC分化的一致性和產(chǎn)量。

人類(lèi)胚胎干細(xì)胞hESCs和人類(lèi)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞hiPSCs的分化需要細(xì)胞聚集，但是細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞常常大小和形狀不一，從而導(dǎo)致不同步分化。為了能解決一致性的問(wèn)題，Zandstra實(shí)驗(yàn)室的博士后Mark Ungrin嘗試?yán)靡恍┕_(kāi)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)獲取單細(xì)胞懸浮液聚集體，剛開(kāi)始的時(shí)候，他能得到穩(wěn)定的聚集細(xì)胞，但是之后這些細(xì)胞就紛紛死了，他回憶道，“不同實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的大小都不一致，有時(shí)我在一個(gè)孔里能發(fā)現(xiàn)幾種聚集細(xì)胞。”

Ungrin花了6個(gè)月的時(shí)間鉆研細(xì)胞培養(yǎng)基，之后，他開(kāi)始轉(zhuǎn)向細(xì)胞本身，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)重要的因素：一個(gè)是他驚訝的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)幾代傳代的成熟的hESCs一般都會(huì)形成穩(wěn)定的細(xì)胞聚集，而在分化前階段的細(xì)胞則傾向于形成單細(xì)胞懸浮，因此Ungrin決定在細(xì)胞分化之前收集細(xì)胞。另外一個(gè)發(fā)現(xiàn)就是一種Rho關(guān)聯(lián)的激酶，這種小分子抑制劑在之前的研究中發(fā)現(xiàn)能提高細(xì)胞存活率，Ungrin發(fā)現(xiàn)對(duì)于他的干細(xì)胞，這種小分子也起作用。

Ungrin表示，“進(jìn)行人類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究zui令人頭疼的事之一，就是你在實(shí)驗(yàn)室中做的工作很難重復(fù)，而你又不知道是什么原因”，即使是用不同的移液器進(jìn)行平板轉(zhuǎn)移，也有可能造成不同的結(jié)果。因此Ungrin建議研究人員除了記住培養(yǎng)基，還要記住自己細(xì)胞的年齡階段和狀態(tài)，這些都會(huì)影響存活率。

干細(xì)胞培養(yǎng)確實(shí)是頗令人煩惱的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，這是許多剛進(jìn)行干細(xì)胞研究的實(shí)驗(yàn)人員所沒(méi)有意料到的，不過(guò)通過(guò)越來(lái)越多積累的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)也許能漸漸悟出其中的前因后果，不過(guò)也可以利用一些商品化的產(chǎn)品幫助我們盡快的解決這些問(wèn)題。

針對(duì)干細(xì)胞培養(yǎng)，的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品公司HyClone（屬于Thermo Scientific）推出了AdvanceSTEM系列產(chǎn)品，這一系列產(chǎn)品主要支持小鼠干細(xì)胞研究的各種應(yīng)用，包括細(xì)胞擴(kuò)增，保持小鼠胚胎干細(xì)胞和人成體間質(zhì)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，將間質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)一的分化成神經(jīng)元，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等類(lèi)型的細(xì)胞等等。

其中AdvanceSTEM™推薦的DMEM是一款低滲DMEM，這款產(chǎn)品具備一般常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素（生長(zhǎng)因子等），重要的是具有與小鼠胚胎干細(xì)胞相近的*滲透壓，而且其特異的配方保證在37℃5%CO2的培養(yǎng)條件下能夠保持生理狀態(tài)下的pH，這些對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)和保持一致性非常有好處，另外可以在這個(gè)DMEM中加入AdvanceSTEM™血清替代物，幫助使胚胎干細(xì)胞保持在未分化的狀態(tài)，AdvanceSTEM™血清替代物是一種無(wú)血清培養(yǎng)物，血清是動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)常見(jiàn)的培養(yǎng)液，在某些情況下不能用血清培養(yǎng)細(xì)胞，比如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用。

另外Invitrogen公司在今年5月就推出了*間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，專(zhuān)門(mén)用于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）或來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞的培養(yǎng)。STEMPRO MSC SFM是*限定的，意味著培養(yǎng)基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這個(gè)培養(yǎng)基能使MSC維持未分化狀態(tài)超過(guò)9代，而用傳統(tǒng)的加血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在5代后就開(kāi)始出現(xiàn)分化。此外，Invitrogen還推出了一種*限定的無(wú)動(dòng)物來(lái)源的干細(xì)胞基質(zhì)，用于胚胎、間充質(zhì)和神經(jīng)干細(xì)胞的附著和擴(kuò)增。（其中STEMPRO MSC SFM入圍了本年度創(chuàng)新產(chǎn)品評(píng)比的候選名單，歡迎大家投票）

2.尋找標(biāo)記

來(lái)自維吉尼亞共和國(guó)大學(xué)在干細(xì)胞生物工程學(xué)家Raj Rao希望能利用細(xì)胞表面標(biāo)記物了解人類(lèi)胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控胚胎干細(xì)胞，但是目前對(duì)于評(píng)估hESCs的多能性，以及胚胎干細(xì)胞在分化的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生什么樣的變化，并沒(méi)有設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。通常采用的細(xì)胞標(biāo)記包括階段特異性胚胎抗原3和抗原4（SSEA-3和SSEA-4），但是不同的細(xì)胞系在SSEA-3和SSEA-4的表達(dá)上差別較大，很難統(tǒng)一。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，Rao利用了一種在胚胎發(fā)育過(guò)程中結(jié)合和修飾細(xì)胞表面糖組分的蛋白：凝集素lection。小鼠ESC有關(guān)的文獻(xiàn)表明，在發(fā)育的植入前和植入階段，凝集素受體會(huì)展示在細(xì)胞表面。Rao研究小組對(duì)14種不同的凝集素進(jìn)行了分析，希望能找到與SSEA-4同時(shí)表達(dá)的凝集素，結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)了一些這種蛋白，比如蓖麻凝聚素（Ricinus communis agglutinin），懷槐凝集素（Maackia amurensis），這些蛋白可以緊緊的結(jié)合在hESCs上，能用于預(yù)測(cè)多能性。

Rao表示，你實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記越多，那么就越能證明細(xì)胞的多能性。對(duì)于希望進(jìn)行凝集素檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的研究人員而言，這種方法相對(duì)直接和便宜，需要的只是一些抗體，和一臺(tái)臺(tái)式的流式細(xì)胞儀。

但是要記住，對(duì)于不同的細(xì)胞系，甚至是同一細(xì)胞系的不同細(xì)胞群，凝集素和其它細(xì)胞表面標(biāo)記物，比如SSEA-4的表達(dá)都是不相同的，要想增加結(jié)果的可信度，可行的一個(gè)辦法就是增加分析樣品的數(shù)目。

其中Rao提到的這兩種抗體，默克，Invitrogen等廠家可以提供，至于臺(tái)式流式細(xì)胞儀，可以考慮下占市場(chǎng)較大份額的公司：美國(guó)的BD（Becton Dickinson）公司和貝克曼Beckman Coulter公司（原名稱(chēng)Couter）。

BD的流式細(xì)胞儀，不消說(shuō)，是經(jīng)典中的經(jīng)典，其生產(chǎn)的產(chǎn)品都冠以FACs（fluorescence-activated cell sorter）熒光激活細(xì)胞分選儀的名稱(chēng)——FACs即流式細(xì)胞儀的縮寫(xiě)，這不僅說(shuō)明了BD生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的時(shí)間早，也說(shuō)明了其流式細(xì)胞儀的品質(zhì)高，近期國(guó)內(nèi)進(jìn)行的重組桿狀病毒的研究就是利用的他家的流式細(xì)胞儀。BD的流式細(xì)胞儀產(chǎn)品型號(hào)比較齊全，包括FACSCount（小型流式細(xì)胞儀）、FACSCAlibur（流式細(xì)胞儀）、FACSAria（流式細(xì)胞分選儀）、FACSVantage SE（多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀）、LSRII（數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀）。這些流式細(xì)胞儀各有各的特點(diǎn)，比如FACSAria流式細(xì)胞分選儀這種臺(tái)式高速細(xì)胞分選儀的出現(xiàn)大大提高了分選性能，同時(shí)還增強(qiáng)了其它功能（具體可見(jiàn)2008技術(shù)點(diǎn)評(píng)：流式細(xì)胞分選）。

近期BD還推出了干細(xì)胞分選試劑盒，這種即用型的多能干細(xì)胞鑒定和分選試劑盒包括了預(yù)滴定的熒光標(biāo)記抗體，實(shí)驗(yàn)設(shè)定磁珠、驗(yàn)證過(guò)的實(shí)驗(yàn)步驟以及軟件分析模板。此試劑盒針對(duì)現(xiàn)有的BD流式細(xì)胞儀優(yōu)化過(guò)，開(kāi)箱即用。即使經(jīng)驗(yàn)不多的流式細(xì)胞儀用戶(hù)，也能快速掌握這種方法。它同時(shí)將分析與分析之間的變異性減至zui低，讓結(jié)果更快更可靠。在抗體用完之后，能輕松補(bǔ)充抗體，滿(mǎn)足特別的研究需求。

另外Beckman Coulter推出的適合篩選量大的實(shí)驗(yàn)室的流式細(xì)胞儀，可以用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床檢測(cè)的許多領(lǐng)域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細(xì)胞、T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定、檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞免疫測(cè)定等。

除了這兩個(gè)*，也可以考慮其它流式細(xì)胞儀，比如Accuri Cytometers、Guava科技公司、Union Biometrica、Amnis等，近期Guava科技公司與Millipore公司宣布將會(huì)獎(jiǎng)勵(lì)給一名科學(xué)家一臺(tái)Guava的流式細(xì)胞儀，價(jià)值10萬(wàn)美元，條件是這名科學(xué)家的創(chuàng)新研究計(jì)劃將會(huì)推動(dòng)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的了解。申請(qǐng)時(shí)間為2009年的1月1日到4月30日，在Millipore和Guava的上都可提交（www.millipore.com 和www.guavatechnologies.com）。有興趣的國(guó)內(nèi)科學(xué)家可以試一下。

3.防止污染

薩克生物研究學(xué)院（the Salk Institute for Biological Studies）的Travis Berggren研究小組通過(guò)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層研究hESC自我更新調(diào)控。但是05年Berggren在WiCell研究院進(jìn)行研究的時(shí)候，許多實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞被支原體污染，這種污染物具有抵抗抗生素的能力，并且不容易觀察到。

研究小組花了兩個(gè)星期的時(shí)間清洗細(xì)胞和培養(yǎng)物，滅菌消毒，但是他們浪費(fèi)的不只是兩個(gè)星期的工作時(shí)間，由于支原體生長(zhǎng)很慢，并且不會(huì)干擾分化，因此研究人員長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的時(shí)間都不知道所研究的細(xì)胞已經(jīng)被污染，即使在發(fā)現(xiàn)了污染物后，一些合作研究人員即使檢測(cè)到了污染，仍然認(rèn)為他們的細(xì)胞能存活，Berggren說(shuō)，“這告訴我們，實(shí)際上早就應(yīng)該進(jìn)行檢測(cè)了。”

因此Berggren的研究小組建立了一個(gè)常規(guī)檢測(cè)過(guò)程，在其后的三年里他們都嚴(yán)格執(zhí)行著這一步驟，每個(gè)星期他們都會(huì)通過(guò)支原體特異性酶或DNA檢查新培養(yǎng)物，每2-4個(gè)星期檢查舊培養(yǎng)物。所有新的培養(yǎng)物質(zhì)，比如用在飼養(yǎng)層的小鼠成纖維細(xì)胞，都會(huì)先經(jīng)過(guò)檢查，并且在使用培養(yǎng)物之前，他們都會(huì)至少驗(yàn)證兩次。

對(duì)于將小鼠ESCs的研究轉(zhuǎn)向人類(lèi)ESCs研究的實(shí)驗(yàn)室而言，支原體特別的麻煩，這是因?yàn)槿祟?lèi)干細(xì)胞在操作上更難，它們更易失去分化潛力，或者死亡。進(jìn)行hiPSCs研究的實(shí)驗(yàn)室也需要注意這個(gè)污染問(wèn)題。

對(duì)于這種情況首先需要的是預(yù)防，確保細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)物沒(méi)有受到支原體的感染，再來(lái)就是需要及時(shí)的發(fā)現(xiàn)支原體感染，檢測(cè)支原體的方法有很多，包括肉眼觀測(cè)方法，PCR方法，熒光檢測(cè)方法，電鏡檢測(cè)方法等，其中比較常見(jiàn)的是PCR方法和熒光檢測(cè)方法，前者譬如Sigma-Aldrich，Stratagene等公司都有相關(guān)的試劑盒，后者用的比較多的是Hoechst公司的相關(guān)產(chǎn)品，具體可見(jiàn)支原體細(xì)胞培養(yǎng)中的大敵。

4.干細(xì)胞分化

美國(guó)ATCC干細(xì)胞中心的華人科學(xué)家馬武（Wu Ma，音譯）研究組在細(xì)胞外基質(zhì)ECM對(duì)于干細(xì)胞自我更新和分化十分關(guān)鍵的這一理論的基礎(chǔ)上，希望能了解ECM中有哪些元素對(duì)于干細(xì)胞形成神經(jīng)祖細(xì)胞具有決定作用。

他們檢測(cè)了兩個(gè)不同的hESCs系，將這兩個(gè)細(xì)胞系鋪在五種不同的基質(zhì)表面：多聚賴(lài)氨酸（poly-D-Lysine），纖維粘連蛋白（fibronectin）,人層連蛋白（laminin）,I型膠原蛋白（type 1 collagen），以及Matrigel（BD公司的一種ECM），結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)laminin上培養(yǎng)的細(xì)胞是分化得的，研究人員也發(fā)現(xiàn)這種效果也與干細(xì)胞整合素受體有關(guān)，因?yàn)樽钄郺6b1受體會(huì)減緩分化。

雖然馬博士發(fā)現(xiàn)了于他的基質(zhì)，但是這并沒(méi)有給出一個(gè)“包治百病”的“藥方”：同一培養(yǎng)機(jī)制對(duì)于不同的細(xì)胞系具有不同的效果，因此馬博士建議，在選擇培養(yǎng)物和其它介質(zhì)的時(shí)候，不僅要了解過(guò)去的干細(xì)胞研究的微環(huán)境如何，還要仔細(xì)看看正常體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中所涉及的細(xì)胞因子。比如說(shuō)要分化成神經(jīng)細(xì)胞，那么就可以看看哪些是大腦發(fā)育過(guò)程中常見(jiàn)的因子，不過(guò)也要注意這也是有局限性的，一些人類(lèi)胚胎干細(xì)胞系在同樣的培養(yǎng)條件下也會(huì)產(chǎn)生多少不一的神經(jīng)細(xì)胞。