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士鋒生物溶血空斑試驗技術
點擊次數：999 發布時間：2013-11-19
一﹑原理
溶血空斑試驗是體外檢測單個抗體形成細胞（b淋巴細胞）的一種方法，即將經綿羊紅細胞（SRBC）免疫過的家兔淋巴結或小鼠脾臟制成細胞懸液，與一定量的SRBC結合，于37℃作用下，免疫活性淋巴細胞能釋放出溶血素，在補體的參與下，使抗體形成細胞周圍的SRBC溶解，從而在每一個抗體形成細胞周圍，形成肉眼可見的溶血空斑。每個空斑表示一個抗體形成細胞，空斑大小表示抗體生成細胞產生抗體的多少。由于溶血空斑試驗具有特異性高，篩選力強，可直接觀察等優點，故可用做判定免疫功能的指標，觀察免疫應答的動力學變化，并可進行抗體種類及亞類的研究。
目前有關溶血空斑試驗的具體方法很多，現僅將瓊脂平板溶血空斑試驗的操作方法簡介如下。
二﹑材料與試劑
（一） 材料
平皿（直徑5.5cm ×1.5cm），溫箱（37℃），水浴箱（45℃），離心機，顯微鏡及白細胞計數器，18g～25g昆明系小鼠等。
（二）試劑
1．SRBC懸液 取無菌脫纖綿羊血（或阿氏液保存的血液），用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗3次，每次2 000r/min離心5min，zui后取壓積紅細胞，懸于滅菌pH值7.2 PBS（含Ca2+、Mg2+）中，使成為20%濃度，經細胞計數后，調整細胞濃度為2.00×109個 /ml。
2. 0.1Mol/ L pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）.
3.低層和頂層瓊脂 將抗補體作用小的瓊脂（日本瓊脂粉或旅大水產制品廠的產品）用PBS配成1.4%和0.7%兩種濃度。將0.7%的瓊脂分裝小試管，每管1.5ml備用。
4.DEAE-右旋糖酐 分子量5萬，用蒸餾水配成1%濃度備用。
5.補體 采集3只以上豚鼠血清，應用時用PBS稀釋成1︰30濃度（如不加DEAE-右旋糖酐，可采用原補體或做1︰5稀釋）。
三﹑操作方法
（一）免疫脾細胞懸液的制備
1．小鼠免疫 每只小鼠經尾靜脈或腹腔注入上述SRBC懸液0.2ml。
2．脾細胞懸液的制備 將免疫后第四天的小鼠拉頸處死，解剖取出脾臟，放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后，去掉結締組織，加入適量的PBS，用彎頭鑷子擠壓脾細胞，稍靜置，吸上清液至離心管中，1 500r/min離心5min，棄上清后，定量加入PBS，混勻，按白細胞計數法計算脾細胞數，zui后用PBS調整細胞數至1.00×107 個/ml，一般每只鼠脾臟細胞數為1×108～1.5×108。
（二） 傾注底層瓊脂
將1.4%瓊脂凝膠加熱融化后，傾注于水平位置的平皿內，每皿2ml～3ml，凝固后，置37℃溫箱，平皿反扣，開蓋1h后備用。
（三） 頂層瓊脂的制備
將0.7%的瓊脂融化后，置于45℃恒溫水浴箱中，依次加入以下試劑：
⑴ 2.00×109/mlSRBC懸液0.1ml。
⑵ 1%DEAE-右旋糖酐0.05ml。
⑶ 1.00×107/ml脾細胞懸液0.1ml。迅速混勻后，傾注于已鋪好底層瓊脂的
平皿內，使之均勻鋪平凝固后，靜置約15min，放37℃溫育1h～1.5h。
（四） 加補體
從溫箱中取出平皿，每皿加入1︰30稀釋的新鮮豚鼠血清1.5ml（如未加DEAE-右旋糖酐，則加原血清或1︰5稀釋的新鮮血清1.5ml），繼續放37℃溫箱中溫育30min后取出，觀察溶血空斑。也可在室溫下放置1h，4℃冰箱，翌日觀察結果。如需保存，可加入用生理鹽水或PBS配制的0.25%戊二醛6ml進行固定。
四、結果判定
觀察時，將平皿對著光亮處，用肉眼或放大鏡觀察每個溶血空斑的溶血狀況，并記錄整個平皿中的空斑數，同時求出每百萬個脾細胞內含空斑形成細胞的平均數。
五、注意事項
⒈ 對SRBC的要求 因為SRBC既是免疫原，也是靶細胞和指示細胞，故要求SRBC應新鮮，洗滌不超過3次，每次2 000r/min離心5min，細胞變形或脆性增大者均不能使用。阿氏液保存的血液可用兩周。
2．免疫所用SRBC的數量 尾靜脈注射以2.00×104 個/0.2ml為宜。腹腔注射為4.00×108 個 /ml，用量小，如低于1.00×107個/ml注射0.5ml，空斑形成極少；用量過大，超過2.50×109個/ml，多不能形成空斑。
3．采取免疫脾的時間 無論是經尾靜脈還是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾為宜，過早或過晚空斑都形成極少。
4．脾細胞的活力 為了保證脾細胞的活力，制備脾細胞過程中所用PBS（或Hank’s液），臨用時方從4℃冰箱中取出，或整個操作過程應在冰浴中進行。
5．傾注平板的要求 底層要平，上層要把握好溫度。
6．補體的活力 補體活力的大小，對溶血空斑的形成關系很大。如出現抗體或補體的活力低下，將不能形成空斑。所以補體要新鮮，并宜將3只以上豚鼠血清混合。試驗中加入Ca2＋、Mg2＋是為了活化補體。DEAE-右旋糖酐是一種多鹽的水溶性物質，由于瓊脂的半乳糖鏈上含有抗補體的硫酸酯基團，DEAE-右旋糖酐能與它形成不可置換的結合，而使之沉淀，從而消除瓊脂的抗補體作用。
7．空斑計數 要求判讀準確，避免辨認造成的誤差。遇可疑空斑時，應鏡檢，對肉眼結果進行核對。