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士鋒生物非標記抗體免疫電鏡實驗技術
點擊次數：830 發布時間：2014-1-10
(一) 原理
標記抗體法雖然具有許多優點，但也存在一些難以克服的問題，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱;化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響;結合物中未標記的抗體可與抗原競爭結合，影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統的非標記抗體的免疫學反應，對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab′)2，一個Fab片段與標本中的抗原結合，一個Fab是抗體蛋白的結合片段。在抗體與標本作用后，再加入鐵蛋白與抗體結合，從而顯示組織內抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負染后，直接電鏡觀察。
(二)材料及試劑
1.待檢病毒材料 如糞便，氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養液等。
2.高速離心機
3.已知抗體
4.磷鎢酸
5.瓊脂糖
6.其它
(三)操作方法
1.經典法
(1)將被檢病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。
(2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃
(3)以17 000r/min～23 000r/min離心90min。
(4)吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體。
(5)沉淀物中加少量H2O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec～30Sec，滴加于400目銅網Fomnvar膜上，用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多余的負染液。
(6)在透射電鏡下4×104倍觀察。
2.快速法(瓊脂擴散法)
(1)同經典法(1)、(2)步驟，制備免疫復合物。
(2)以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml，冷卻凝固后，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。
(3)將普通濾紙剪成2×3cm大小，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。
(4)在凹孔內，加入制備好的含病毒的免疫復合物懸液。
(5)將電鏡載網的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用，20min～30min后，可將液滴的水分吸干，而濃縮的免疫復合物則粘附在載網膜上。
(6)在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec，過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。
(7)于透射電鏡4×104倍下觀察。
(四)結果判定
直接觀察病毒粒子的形態。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入，大大提高了觀察的敏感性。