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士鋒生物APAAP免疫組化實驗操作過程
點擊次數(shù)：1105 發(fā)布時間：2014-1-22
(一) 基本原理
APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技術(shù)的基本原理為: 抗鼠IgG抗體作為橋梁，將鼠源性識別細胞抗原的*抗體與鼠源性的抗堿性磷酸酶單克隆抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物相連接，使之成為Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的復(fù)合物。還可通過二抗將APAAP 復(fù)合物重復(fù)疊加起來，從而使多個堿性磷酸酶標記于組織細胞上*抗體所識別的抗原部位，提高了敏感性。
(二) 方法
分離外周血單個核細胞(PBMC)，洗滌后用含10％FCS犚PMI1640
調(diào)整細胞濃度約5×10６／ml
↓
自制制片機上制片，充分干燥
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用含丙酮-福爾馬林固定液中固定30秒鐘
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自來水、蒸餾水依次沖洗
↓
用TBS稀釋特異性McAb或陰性對照抗體(1∶50～500)，
每片加30～50μl
↓
室溫濕盒孵育30min，或4℃冰箱濕盒中
↓
充分用TBS沖洗后，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG
(GAM或RAM IgG)30～50μl
↓
室溫濕盒孵育30min
↓
TBS沖洗后加堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(1∶2000)復(fù)合物(APAAP)
↓
TBS沖洗后可重復(fù)疊加GAM或RAM IgG和APAAP2次，每次孵育10min
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沖洗后底物液顯色10～15min
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自來水沖洗，蘇木精襯染，光鏡下觀察
(三) 試劑器材
載玻片，制片機，濕盒，光學(xué)顯微鏡
1. APAAP配制：牛腸堿性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS，加抗堿性磷酶單克隆抗體腹水2μl制成，臨用時作1∶2～1∶4稀釋。
2. AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl緩沖液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg，充分混勻，用前配制。必要時加12mg Levamisole以抑制內(nèi)源性堿性磷酸酶。亦可按上述比例少量配制。
3. 丙酮-福爾馬林固定液：4℃保存
100mg Na２HPO４
500mg KH２PO４
150ml H２O
225ml Acetone
125ml Formalin