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士鋒生物聚合酶鏈式反應步驟、體系及問題分析
點擊次數：1163 發布時間：2014-2-17
聚合酶鏈式反應(PCR)是分子生物學常用技術，是體外擴增DNA的方法，設計生物學的各個領域，基本是進了實驗室都必須掌握的技術。對于剛入生物門的我們簡單了解其步驟、反應體系很有必要。
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction ,PCR)步驟
<img alt="聚合酶鏈式反應步驟、體系及問題分析" 聚合酶鏈式反應步驟、體系及問題分析"="" border="1" height="520" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" width="525" style="vertical-align: middle; border: 0px;">
三步：
1 變性：模板DNA加熱變性
2 退火 引物與它的靶序列發生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈
3 延伸 4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點，按5'-3'方向進行延伸。
上面三步為一個循環，可使拷貝數到達2*E-6-2*E-7
PCR 產物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。
PS：
1.首輪擴增，其產物是大小不均一的DNA分子。長度應大于兩引物之間的長度。
在第二個循環中，由于5'固定，其產物長度就由等于兩引物之間的長度。所以幾十個循環后就會產生
大量的兩引物之間序列。
引物設計：
1，長度15~30個核苷酸，zui多到50個核苷酸左右。
2, 盡量避免嘌呤和嘧啶堆積的現象。(其實有時很難避免，不是很重要)。
3,引物內部不應該形成二級結構，如果引物中有酶切位點時，就會出現引物二聚體。(一般不是很重要)
PCR的反應條件
1，dNTP濃度過高會加快反映速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。
2， 引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。
3，TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。
TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。
4， 在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使
TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。
5，DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度
Tm=4(G+c)+(A+T)，一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低;溫度高，不容易退火但特異性高。退火時間30秒。
6，延伸溫度一般在70～75度這是TaqDNA聚合酶活性zui高(150個/S)，當引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當<1KB時在較后的循環中延長擴增時間。
7循環次數25～30次。
無產物時對策：
1，取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增。
2，增加TaqDNA聚合酶濃度
3，增加循環次數
4，降低退火溫度
5，加靶DNA量
PCR時常會遇見電泳沒有條帶，基因片段擴增不出來，zui主要的原因就是引物設計不合理、退火溫度問題、DNA中蛋白雜質較多、PCR反應體系有漏加的物質如dNTP等。