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如何誰用SDS裂解法進行質粒抽取實驗
點擊次數(shù)：1125 發(fā)布時間：2014-2-24
上海士鋒生物科技有限公司本法[根據(jù)Godson和Vapnek(1973)的方法修訂而成]的產量要低得多，但卻比本章所述的其他方法更溫和，是提取大質粒(大于15kb)的方法。
試驗步驟:
1、將500ml細菌沉淀物洗過后重懸于10ml用冰預冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管[橡樹嶺(Oak Ridge)型]中。
2、加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值小于8.0時，溶菌酶不能有效地發(fā)揮作用。
3、加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0)，將管倒置數(shù)次以混勻懸液，在冰上放置10min。
4、加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混勻內容物，使SDS均勻分散到整個細菌懸液中，操作應盡可能溫和小心，以便zui大限度地避免釋放出來的DNA受到剪切。
5、立即加入6ml 5mol/L NaCl(終濃度為1mol/L)，再次用玻棒溫和*地混勻內容物，在冰上放置至少1h。
6、以4℃【用Beckman Ti50型轉頭(或與其相當?shù)霓D頭)】，30 000rpm離心30min，小心將上清轉移到一個50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物。如果細菌碎片未能全部除盡，可用35 000rpm再離心20min，將上清轉移到另一管中，去掉存在離心管內的粘稠狀液體。
7、上清分別用酚/氯仿和氯仿各抽提1次。
8、將水相轉移到250ml的離心瓶中，于室溫加入2倍體積的(約60ml )乙醇，充分混勻，室溫下放置1-2h。
9、以4℃，5000rpm離心20min，回收核酸。
10、離心管倒置于紙巾上，使zui后殘存的乙醇流干，在真空干燥內短時間干燥沉淀物，但不要使之*干燥。
11、用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。