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植物組織中脂肪氧化酶活力的測定
點擊次數：907 發布時間：2014-3-18
脂肪氧化酶（LOX）是一種含非血紅素鐵的蛋白質，專一催化具有順、順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。它廣泛存在于高等植物體內，與植物的生長發育、植物的衰老、脂質過氧化作用和光合作用、傷反應及其他脅迫反應等有關。
【原理】
根據基質濃度一定、反應體系中溶解氧濃度的變化與酶活力大小呈線性相關的原理進行測定。LOX氧化多元不飽和脂肪酸形成具有共軛雙鍵的過氧化氫物時消耗氧氣，溶液中氧濃度的減少速率與酶活力大小成正比，利用氧電極可以地測定酶活力。
【儀器與用具】
氧電極1套；記錄儀1臺；超級恒溫水浴鍋1臺；離心機1臺；抽濾器1套；1ml注射器1支；吸量管：5ml 1支，1ml 1支；吸耳球1個；小研缽1套；剪刀1把。
【試劑】
0.25%亞油酸；Tris-鹽酸緩沖液（25mmol/L，pH7.5）；石英砂；0.5mol/L氯化鉀溶液；
【方法】
1.樣品提取 取新鮮植物樣品，擦凈組織表面污物，剪碎混勻，稱取0.5g放入研缽中，加入5ml 25mmol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH7.5），于冰浴中研磨，研成均漿，利用高速冷凍離心機于0~4℃條件下離心（4000×g）5min，上清液為粗酶提取液。
2.測定 氧電極的操作方法見儀器的操作手冊。開啟恒溫水浴，調節測定溫度為25℃。
洗凈氧電極反應杯，先加入2.5mlTris-鹽酸緩沖液、1ml酶提取液，放松磁力攪拌制動器，保溫平衡5~10min，制動磁塊，把電極插入反應杯中，從狹槽中排出全部空氣，用1ml注射器加長針頭從狹槽中注入0.25%亞油酸0.2ml，打開記錄儀記錄耗氧曲線（走紙速度的大小視酶活力確定，曲線呈45度角為宜），測定5min，吸取廢液，清洗反應杯進行下一個樣品的測定。
3.計算結果
本實驗以空氣飽和水中的含氧量為標準對電極進行標定，求算出測定溫度下，記錄紙每個小格所代表氧量的變化值。
從樣品測定曲線上選定耗氧的下降格數（n），根據走紙速度（v）和下降n格走紙的距離（L），可求出測定液中耗氧的變化速率（R）：
R（μmol O2/min）＝n×μmol O2/格×v/L
根據提取液體積和樣品重量，即可求出LOX的活力：
LOX(μmol·g﹣1·min﹣1)=R×V/W
式中 V－提取液的體積；
W－樣品鮮重。