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士鋒生物植物細胞的懸浮培養技術
點擊次數：1227 發布時間：2014-3-21
將游離的植物細胞或小的細胞團置于液體培養其中進行培養和生長的一種技術，稱為植物細胞懸浮培養。它是從愈傷組織的液體培養基礎上發展起來的一種新的培養技術。從50年代起，米爾（Muir）等便對單細胞培養進行了探討和研究，得到了萬壽菊，煙草單細胞和細胞團的懸浮液。1958年斯圖爾德（F.C.Steward）等進行了胡蘿卜愈傷組織的懸浮培養，并得到了完整的再生植株。
三十多年來，從試管的懸浮培養發展到大空量的發酵罐培養，從不連續培養發展到半連續和連續培養。80年代以來，作為生物技術中的一個組成部分，正在發展成為一門新興的產業體系。懸浮培養技術為研究植物細胞的生理、生化、遺傳和分化的機理提供實驗材料，也為利用植物細胞進行次和代謝物的工業生產提供技術基礎。此外，還在育種、快速繁殖、原生質體培養，體細胞雜交以及作為基因轉化的受體等方面均得到了廣泛地應用。
由于植物細胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像細菌細胞那樣各自分開，而是大多以細胞團的形式存在，至今還不能培養*是單細胞的縣浮液。要進行單細胞培養或選擇細胞無性紗，需要進行平板培養，微室培養和看護培養。本實驗僅介紹zui常用的縣浮培養技術。
一、實驗目的：
1． 掌握植物懸浮細胞系建立的方法，原理。
2． 學會對懸浮細胞培養物進行細胞計數及繪制細胞生長曲線。
二、實驗原理：
植物離體培養可產生愈傷組織。將疏松型的愈傷組織縣浮在液體培養基中并在振蕩條件下培養一段時間后，可形成分散縣浮培養物。良好的縣浮培養物應具備以下特征：（1）主要有單細胞和小細胞團組成；（2）細胞具有量盛的生長和分裂能力，增殖速度快；（3）大多數細胞在形態上應具有分生細胞的特征，它們多呈等徑形，核一質比率大，胞質濃厚，無液胞化程度較低。要建成這樣的縣浮培養體系，首先需要有良好的起始培養物——迅速增殖的疏松型愈組織。然后經過培養基成分和培養條件的選擇，并經多次斷代培養才能達到。縣浮培養細胞經長期繼代培養后，染色體常有變異現象，細胞的再生能力也有逐漸降低的趨勢，然而對于以上生產有用代謝特質為目的的大量培養，這種再生能力的降低不一定有不良影響。
2．材料
松軟的煙草或胡蘿卜愈傷組織。
3．試劑
（1）附加2%蔗糖，1%甘露醇，500mg/L水解乳蛋白，1。5ml/L，2，4-D的MS培養基，PH調到5.6~6.2。
（2）8%三氧化鉻（CrO3）。
三、實驗方法
1.用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入三角瓶中并輕輕夾碎。每100ml三角瓶含滅過菌MS培養基10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織，以保證zui初培養物中有足夠量的細胞。
2.將已接種的三角置于旋轉式搖床上。在100r/min，25~28℃條件下，進行振蕩培養。
3.經6~10天培養后，若細胞明顯增殖，可向培養瓶中加新鮮培養基10ml，必要時，可用大口移液管將培養物分裝成兩瓶，繼續培養。（若細胞無明顯增殖，可能是起始材料不適當，應考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）。可進行*次繼代培養。
4.縣浮培養物的過濾：按“3”法繼代培養幾代后，培養液中應主要由單細胞和小細胞團（不多于20個細胞）組成。若仍含有效大的細胞團，可用適當孔徑的金屬網篩過濾，再將過濾后的縣浮細胞繼續培養。
5.細胞計算。取一定體積的細胞縣液，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置700C水浴處理15min。冷卻后，用移液管重復吹打細胞懸液，以使細胞充分分散，混勻后，取一滴縣液置入血細胞計數板上計數。
6.制作細胞生長曲線：為了解縣浮培養細胞的生長動態，可用以下方法繪制生長曲線圖：
（1）鮮重法（fresh weigh method）
在轉代培養的不同時間，取一定體積的懸浮細胞培養物，離心收集后，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養時間為橫座標，繪制鮮重增長曲線。
（2）干重法（dry weigh method ）
可在稱量鮮重之后，將細胞進行曲烘干，再稱量干重。以干重為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制細胞干重生長曲線。
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次，共取7次，每個樣品重復三次，整個實驗進行期間不再往培養瓶中換入新鮮培養液。
7.細胞活力的檢查。對于初學者，往往需要檢測活細胞的比率。可在培養的不同階段，吸取一滴細胞縣液，放在載玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花紅溶液（用培養基配制）染色，在顯微鏡下觀察。幾活細胞均不著色，而死細胞則很快被染成紅色。也可用0。1%熒光雙醋酸酯溶液染色，凡活細胞將在紫外光誘發下顯示藍絕色熒光，有經驗的操作者，則可根據細胞形態，胞質環流判別細胞的死活。
8.細胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養細胞是否仍具有再生能力，可將培養細胞轉移到瓊脂固化的培養基上，使基再形成愈傷組織，進而在分化培養基上，誘導植株的分化。
四、注意事項：
1.上述步驟均滅菌操作，培養基、用具、器皿等要高壓滅菌后方可使用。
2.如培養液混濁或呈現乳白色，表明已污染。
3.每次繼代培養時，應在倒置顯微鏡下觀察培養物中各類細胞及其它殘余物的情況以有意識地留下圓細胞，棄去長細胞。