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士鋒生物微生物的誘變育種
點擊次數：1087 發布時間：2014-4-3
一、實驗目的和內容
目的：以紫外線誘變獲得用于醬油生產的高產蛋白酶菌株為例，學習微生物誘變育種的基本操作方法。
內容：1．對米曲霉(Aspergills oryzae )出發菌株進行處理，制備孢子懸液。
2．用紫外線進行誘變處理。
3．用平板透明圈法進行兩次初篩。
4．用搖瓶法進行復篩及酶活性測定。
二、實驗材料和用具
米曲霉斜面菌種；
豆餅斜面培養基、酪素培養基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養皿(9cm)、恒溫搖床、恒溫培養箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈。
三、操作步驟
(一)出發菌株的選擇及菌懸液制備
1．出發菌株的選擇 可直接選用生產醬油的米曲霉菌株，或選用高產蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌懸液制備 取出發菌株轉接至豆餅斜面培養基中，30℃培養3～5d 活化。然后孢子洗至裝有1mL 0.lmol/L pH6.0 的無菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿瓶底為宜)，30℃振蕩30min，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾，制成把子懸液，調其濃度為106～108 個/mL，冷凍保藏備用。
(二)誘變處理
用物理方法或化學方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定，有時還可采用復合處理，可獲得更好的結果。本實驗學習用紫外線照射的誘變方法。
1．紫外線處理 打開紫外燈(30W)預熱20min。取5mL 菌懸液放在無菌的培養皿(9cm)中，同時制作5 份。逐一操作，將培養皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照射l min 后打開培養皿蓋，開始照射，與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進行攪拌，即時計算時間，照射時間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h 然后在紅燈下稀釋涂菌進行初篩。
2．稀釋菌懸液 按10 倍稀釋至10-6，從10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培養基平板中(每個稀釋度均做3 個重復)，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養基后倒置，于30℃恒溫培養2～3d。
(三)優良菌株的篩選
1. 初篩 首先觀察在菌落周圍出現的透明圈大小，并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50 個，作為復篩菌株。
2．平板復篩 分別倒酪素培養基平板，在每個平皿的背面用紅筆劃線分區，從圓心劃線至周邊分成8 等份，1～7 份中點種初篩菌株，第8 份點種原始菌株，作為對照。培養48h 后即可見生長，若出現明顯的透明圈，即可按初篩方法檢測，獲得數株二次優良菌株，進大搖瓶復篩階段。
3．搖瓶復篩 將初篩出的菌株，接入米曲霉復篩培養基中進行培養，其方法是，稱取麥秩85g，豆餅粉(或面粉)15g，加水95～110mL(稱為潤水)，水含量以手捏后指縫有水而不
下滴為宜，于500mL 三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm)，121℃濕熱滅菌30min，然后分別接入以上初篩獲得的優良菌株，30℃培養，24h 后搖瓶一次并均勻鋪開，再培養24～48h，共培養3～5d 后檢測蛋白酶活性。
4．蛋白酶的測定方法
(1)取樣：培養后隨機稱取以上搖瓶培養物1g，加蒸餾水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液測定酶活性。另取lg 培養物于105℃烘干測定含水量。
(2)酶活性測定：30℃ pH7.5 條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白)，每分鐘產酪氨酸1μg 為一個酶活力單位。計算公式為：
(A 樣品OD680nm 值-A 對照OD680nm 值)×K×V/t×N
K：標準曲線中光吸收為“1”時的酪氨酸微克數；
V：酶促反應的總體積；
t： 酶促反應時間(min)；
N：酶的稀釋倍數。
5．谷氨酸的檢測 此項檢測也是醬油優良菌株的重要指標之一。
檢測培養基：豆餅粉：麩夫=6：4，潤水75%，121℃濕熱滅菌30min。
谷氨酸測定：于以上培養基中加入7%鹽水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d 后過濾，以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法)。
四、注意事項
1. 紫外線照射時注意保護眼睛和皮膚。
2. 誘變過程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進行，并在黑暗中培養。
五、實驗報告
1. 試列表說明高產蛋白酶菌株的篩選過程和結果。
2. 你認為以上的篩選方法有什么優缺點，如何改進？
六、問題和思考
1．試述紫外線誘變的作用機理及其在具體操作中應注意的問題。
2．為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養一段時間？
注：篩選菌株數的計算 若按突變率為0.01 計算，則一次篩選可取250—300 個菌落，
*次篩選后可多選幾株高產株，而二級篩選為重點階段，其zui適量可參考以下計算方法：如初篩菌株數為200 株，二次篩選欲選株數為2 株，則二級應選(200×2)1/2，為20 株，這樣的數量選擇，使有可能從較少的數量中獲得相對較多的優良菌株。