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士鋒生物植物組織中氨基轉移反應及氨基酸的層析分離
點擊次數：995 發布時間：2014-4-8
一、目的
轉氨基作用是植物界普遍存在的一種生化反應，它使蛋白質、氨基酸代謝
與碳水化合物、脂肪等代謝溝通起來，在一定程度上起平衡蛋白質、脂肪等代
謝的作用。研究植物體轉氨基作用，可以使我們了解植物體不同發育階段代謝
動態的一個側面，從而探索控制其代謝的途徑。
二、原理
通過轉氨基作用，α—氨基酸上的氨基可能轉移到α—酮基的位置上，結
果形成一種新的α—酮酸和一種新的α—氨基酸。所生成的氨基酸可用紙上層
析法檢出。
三、儀器和試劑
1．儀器：
研 缽 恒溫箱 量筒（10毫升）
離心機 試管3支 層析缸
濾 紙 吹風機 移液管（0.5ml×3；2ml×1）
毛細管 漏 斗 離心管
2．試劑：
（1）0.1M丙氨酸
（2）0.1Mα—酮戊二酸（NaOH中和至pH7）
（3）含有0.4M蔗糖的0.1M pH8.0磷酸緩沖液
（4）0.1M谷氨酸、0.1—0.25%茚三酮丙酮溶液
（5）推動劑（酚：水＝3：1或4：1）
四、操作
1.酶液的制備：取發芽2-3 日的綠豆芽3 克（去皮），放入研缽中，加2
毫升pH8.0磷酸緩沖液研成勻漿，轉入離心管。研缽再用2毫升緩沖液沖洗，
并入離心管，于8000轉/分離心10分鐘，取上清液備用。
2．酶促反應：取三支試管，按下表分別加入試劑和酶液：
植物組織中氨基轉移反應及氨基酸的層析分離
搖勻后置試管于37℃恒溫中保溫30分鐘。取出后各加3滴30%乙酸終止酶活動，于沸水浴上加熱10分鐘，使蛋白質*沉淀，冷卻后離心或過濾、取上清液或濾液備用。
3．層析：取層析濾紙一張，在距底邊2厘米處用鉛筆劃一水平線，在線上等距確定5個點，作點樣位置。相鄰各點相距2.5厘米。取上述上清液或濾液及谷氨酸、丙氨酸標準液用五支毛細玻管分別點樣。反應液點5-6滴，標準液點2滴。每點一次用吹風機吹干后再點下一次。不要點得太多，斑點直徑不超過3 ㎜為宜（5 支毛細管勿混淆）。
在層析缸中放入酚水推動劑(3：1或4：1)，待缸內蒸氣飽和后，將濾紙垂直放入，展層，層析紙紙邊不能迭在一起或與缸壁接觸。蓋好缸蓋，待溶劑上升至10-15 ㎝時，小心取出濾紙用鉛筆劃出溶劑前沿線，用電吹風烘干。
4．顯色：用噴霧器噴上0.1%茚三酮丙酮溶液，置烘箱(80℃)或用熱吹風機加熱顯色，此時可見紫色斑點。
五、結果分析
樣品層析后，常用相對移動速率Rf 來表示各組分在層析譜上的位置：
植物組織中氨基轉移反應及氨基酸的層析分離
Rf 值與欲分離物質的性質存在一定的關系，在一定條件下是常數。從層析圖譜上鑒定α-酮戊二酸和丙氨酸是否發生了轉氨基反應并寫出反應式。
六、注意事項
1.品不要點得太多，斑點直徑不超過3 ㎜為宜。
2. 層析紙質量要好一點，否則容易彎曲，層析效果不好。層析時，且紙邊不能迭在一起或與缸壁接觸。