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聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點
點擊次數：1632 發布時間：2014-4-25
等電點聚焦（isoelectric focusing, IEF）或簡稱電聚焦（electrofocusing），也曾稱等電點分離聚焦電泳等。它是60年代中期出現的技術，克服了一般電泳易擴散的缺點。近年來，等電點聚焦電泳又有了新的進展，可以分辨等電點只差0.001pH單位的生物分子。由于它的分辨力高、重復性好、樣品容量大、操作簡便、迅速，在生物化學、分類學、分子生物學及臨床醫學研究等諸方面，都得到廣泛應用。
等電點聚焦電泳產生pH梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩沖液相互擴散，在混合區形成pH梯度，此為人工pH梯度。這種pH梯度不穩定，常用于制備電泳；另一種是利用載體兩性電解質在電場作用下形成自然pH梯度。本實驗就是利用載體兩性電解質形成的自然pH梯度進行蛋白質樣品等電焦聚電泳的。
理想的載體兩性電解質應該在其本身的等電點處有足夠的緩沖能力和良好的導電性，且分子量要小，組成與被分析樣品有所區別，對分析樣品無變性作用或發生化學反應。常用的載體兩性電解質是一系列脂肪族多氨基和多羧基類的混合物，即是一系列的異構物和同系物，分子量在300—1000之間，各組分的等電點(pI)既有差異又相接近，pI的范圍在2.5—11之間。合成載體兩性電解質的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反應如下：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點
R1和R2為氫或帶有氨基的脂肪基。這一反應的特點是生成眾多的異構物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等電點的分布，取決于原材料的性質、比例和合成條件。目前常用的載體兩性電解質的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近來已有國產商品了。不同廠家合成的方法不同，電泳的條件也略有不同。目前，載體兩性電解質商品在使用時還存在一些問題，如樣品中的鹽濃度對pH梯度有影響等，但畢竟優點很多，仍然得到廣泛應用。
分析載體兩性電解質的結構可知，它既有酸性基團(—NH3+ )，也有堿性基團(—COO- )，既可接受分子，也可釋放質子：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點
它們在酸性條件下帶正電荷，在堿性條件下帶負電荷。當它們所帶的正負電荷相等時，其凈電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH值為該兩性電解質的等電點，以pI表示。所以兩性電解質的等電點在數值上等于它呈電中性時溶液的pH值。等電點是反映兩性電解質在溶液中得失質子的能力，是它的物化性質。兩性電解質在溶液中的行為可以從兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質。如溶液是pH7，對pI=9的兩性電解質來說，是處于酸性環境，故帶正電荷；但對pI=3的兩性電解質來說，卻是處于堿性環境，故而帶負電荷。所以，不同pI的兩性電解質，在同一環境中帶有不同性質和數量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質又破壞了水的解離平衡：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測定蛋白質等電點使溶液pH有所改變。當某一兩性電解質pI較低，即釋放質子（H+）能力較強，使溶液pH值下降，這類兩性電解質稱為酸性兩性電解質；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質。所以，在溶液中的兩性電解質一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質；另一方面，它又影響周圍環境（水溶液），使其pH值有所改變。