會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://www.grannyfreesex.com/st236594/
士鋒生物電泳、轉(zhuǎn)膜
點(diǎn)擊次數(shù)：913 發(fā)布時(shí)間：2014-5-7
轉(zhuǎn)膜是把DNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進(jìn)行各種后續(xù)研究（如RFLP分析，陽(yáng)性克隆的篩選驗(yàn)證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誗outhern Blotting的原理及操作步驟
實(shí)驗(yàn)原理：
1. 轉(zhuǎn)膜的方式：
向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移
向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移
同時(shí)向兩張膜轉(zhuǎn)移
電轉(zhuǎn)移
真空轉(zhuǎn)移
2. 固相支持物的種類及選擇：
硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失DNA，< 500 bp的DNA無(wú)效，轉(zhuǎn)膜前的工作（從提高轉(zhuǎn)膜效率，利于轉(zhuǎn)膜后使用等）
尼龍膜（帶正電荷的）高強(qiáng)度，不易破損，具有較大的DNA結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價(jià)結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，無(wú)論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用10次以上（10-20次），經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在80-100℃真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。
3. 轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）的選擇：
帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC），但不能充分發(fā)揮膜潛能；0.4N NaOH，共價(jià)結(jié)合DNA是zui大優(yōu)點(diǎn)。
硝酸纖維膜：高鹽離子強(qiáng)度促進(jìn)DNA與膜結(jié)合（20×SSC），低鹽離子強(qiáng)度導(dǎo)致小片段DNA在轉(zhuǎn)移過程中丟失，pH>9，DNA不能與膜結(jié)合。
4．轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約12 hrs
效率高低，但已無(wú)補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。
實(shí)驗(yàn)材料及試劑：酶消化好的DNA樣品，尼龍膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等
實(shí)驗(yàn)步驟：
1． 0.8%瓊脂糖電泳
制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml 0.8%瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經(jīng)濟(jì)，）
制樣，點(diǎn)樣：DNA樣品中指示劑量稍多
電泳：一般1-1.5V/cm的電壓， 使DNA遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng)10-11cm (大電泳槽：40V×12-15hrs，小電泳槽30V×4-5 hrs)
2．轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：
依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙（11×12.5 cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10×10.5cm），兩個(gè)玻璃盤、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。
3．一玻璃盤中加入足量的0.4N NaOH，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋(操作示范)。
4．凝膠的預(yù)處理:
a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（zui后一個(gè)樣品的zui前端）作為電泳方向記號(hào)
b) 把凝膠翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）
c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠
d) 倒去蒸餾水，加0.4N NaOH中和
e) 同時(shí)在鹽橋?yàn)V紙上灑些0.4 NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）
5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）
6．在膠面上倒足夠量0.4N NaOH，小心放置膜（預(yù)濕0.4N NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動(dòng)）
7．膜上放2張濾紙，濾紙大小為15×12cm
8．放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉(zhuǎn)膜12 hrs左右
9．轉(zhuǎn)膜完畢，用2×SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。用EB染膠以檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。
10．用兩張濾紙包住膜，置于80-100℃的真空干燥箱中，干燥2-4 hrs。