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【 實(shí)驗(yàn)原理】

1. 電泳的基本原理

帶電顆粒在電場(chǎng)中向著與其電性相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。

電泳時(shí)不同的帶電粒子在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同。帶電顆粒 ( 球形分子 ) 在電場(chǎng)中的電泳速度 (V)

實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳

從上式看出，帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度 (V) 與顆粒帶電荷量 (Q) 以及電場(chǎng)強(qiáng)度 (E) 成正比，與球形分子的大小 ( 半徑為 r ) 及所在介質(zhì)的粘度 (η) 成反比。因此 , 在同一電場(chǎng)、同一介質(zhì)中進(jìn)行電泳時(shí)，帶不同電荷，不同大小的顆粒就可以通過(guò)電泳而被分離。

在實(shí)際操作中，為了不考慮不同電壓對(duì)電泳速度的影響，我們常用遷移率（ move rate,M ）來(lái)表示帶電顆粒的電泳特性，遷移率指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度，即

實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳

可見(jiàn)，帶電顆粒的凈電荷越多，分子顆粒越小，在電場(chǎng)中的遷移率就越快；反之越慢。但電泳速度和電泳遷移率是兩個(gè)不同的概念，后者有利于不同電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳結(jié)果的比較，各種帶電顆粒在一定條件下測(cè)得的遷移率是一個(gè)常數(shù)。

2. 影響電泳的主要因素

(1) 電泳介質(zhì) pH 值的影響 : 對(duì)于蛋白質(zhì)和氨基酸等兩性分子，電泳介質(zhì)的 pH 值影響蛋白質(zhì)的電離情況，即可決定蛋白質(zhì)的帶電量 (Q) 。 pH 值小于等電點(diǎn)，分子帶正電荷，向負(fù)極泳動(dòng)，如果 pH 大于等電點(diǎn)，分子帶負(fù)電荷，向正極泳動(dòng)。 pH 值偏離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，分子所帶凈電荷越多，其泳動(dòng)速度越快。當(dāng)緩沖液 pH 等于其等電點(diǎn)時(shí)，分子處于等電狀態(tài)，不移動(dòng)。由于血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)多在 pH4 ～ 6 之間，因此，分離血清蛋白常用 pH 8.6 的巴比妥緩沖液或三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 緩沖液。

(2) 緩沖液的離子強(qiáng)度 : 離子強(qiáng)度低，電泳速度快，分離區(qū)帶不易清晰；離子強(qiáng)度高，電泳速度慢，但區(qū)帶分離清晰。如離子強(qiáng)度過(guò)低，緩沖液的緩沖量小，不易維持 pH 的恒定；離子強(qiáng)度過(guò)高，則降低蛋白質(zhì)的帶電量 ( 壓縮雙電層 ) 使電泳速度減慢。所以常用離子強(qiáng)度為 0.02 ～ 0.2 之間。

(3) 電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 : 電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳速度成正比關(guān)系。電場(chǎng)強(qiáng)度以每厘米的電勢(shì)差計(jì)算，也稱電勢(shì)梯度。如紙電泳的濾紙長(zhǎng) 15cm ，兩端電壓 ( 電勢(shì)差 ) 為 150V ，則電場(chǎng)強(qiáng)度為 150 ／ 15=10 V ／ cm ，電場(chǎng)強(qiáng)度愈高，則帶電粒子的移動(dòng)愈快。 隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增高，電流強(qiáng)度增加，產(chǎn)熱也增多。產(chǎn)熱的不良后果是： ① 引起水的蒸發(fā)，改變?nèi)芤?pH 及離子強(qiáng)度； ② 引起介質(zhì)溫度高，可使蛋白質(zhì)變性。因此電泳必須控制電壓在一定范圍之內(nèi)，當(dāng)進(jìn)行高壓電泳時(shí)，必須裝備有效的冷卻裝置。

(4) 電滲 : 在電場(chǎng)中，由于多孔支持物吸附水中的離子使支持物表面相對(duì)帶電，在電場(chǎng)作用下，溶液就向一定方向移動(dòng)，此種現(xiàn)象稱為電滲。如紙上電泳所用的濾紙纖維素帶有負(fù)電荷；瓊脂糖電泳中，所用的瓊脂糖由于大量硫酸根的存在也帶有負(fù)電荷，它們使水感應(yīng)產(chǎn)生水合氫離子 (H+3O) 。在外電場(chǎng)的作用下，水向負(fù)極移動(dòng)。如果被測(cè)定樣品也帶正電荷，則移動(dòng)更快；如果被測(cè)定樣品帶負(fù)電荷，則移動(dòng)減慢。所以電泳時(shí)，顆粒泳動(dòng)所表現(xiàn)的速度決定于顆粒本身的泳動(dòng)速度和溶液的電滲作用。因此在選用支持物時(shí)，應(yīng)盡量避免高電滲作用的物質(zhì)。

3. 醋 酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物的電泳技術(shù)。醋酸纖維薄膜具有勻一的泡沫狀結(jié)構(gòu)（厚約 120 μ m ），滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)無(wú)阻力，用它做區(qū)帶電泳的支持物，用樣量少，分離清晰，無(wú)吸附作用，應(yīng)用范圍廣和快速簡(jiǎn)便 , 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。

本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜作為支持物，于薄膜一端加微量血清，膜兩端連接于緩沖液。血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)均低于 pH7.0 ，電泳時(shí)常采用 pH8.6 的緩沖液，因此，各種蛋白質(zhì)皆帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，因泳動(dòng)速度不同而被分離。醋酸纖維素薄膜電泳可把血清蛋白質(zhì)分離為清蛋白 A 、 α1 、 α2 、 β 和 γ - 球蛋白，將蛋白質(zhì)染色后，可按染色區(qū)帶位置進(jìn)行定性觀察，也可對(duì)各條色帶進(jìn)行定量測(cè)定。

【 器材和試劑】

1. 器材 電泳儀、醋酸纖維素薄膜（ 2.5 cm ×8cm ）、染色液盤、漂洗盤、鑷子

2. 試劑

(1) 巴比妥緩沖液（ pH8.6 ，離子強(qiáng)度 0.075 ）：巴比妥鈉 15.46g ，巴比妥 2.78g 加蒸餾水?dāng)?shù)百毫升 , 加熱溶解后再補(bǔ)加蒸餾水至 1000ml, 混勻。

(2) 染色液：氨基黑 10B 0.5g ，溶于甲醇 50ml 中，再加冰醋酸 10ml ，蒸餾水 40ml 混勻。

(3) 漂洗液：甲醇（或 95% 乙醇） 45ml ，冰醋酸 5ml ，蒸餾水 50ml 混勻。

(4) 洗脫液： 0.4mol/L NaOH 溶液

(5) 透明液： 95% 乙醇 75ml ，冰醋酸 25ml 混勻。

【 操作步驟】

1. 點(diǎn)樣 將醋酸纖維薄膜 (2.5cm×8cm) 一條，浸于巴比妥緩沖液，待*浸透后，取出輕輕夾于濾紙中，吸去多余的溶液，再于薄膜的無(wú)光澤面的一端 2.0cm 處，用小玻片蘸取少許血清，垂直印于膜上，待血清滲入薄膜后，以無(wú)光澤面向下，兩端用數(shù)層浸濕的濾紙 ( 或紗布 ) 貼緊，加蓋，平衡 2 ～ 3min ，然后通電。

2. 通電 一般電壓用 110 ～ 140V ，電流約 0.4 ～ 0.6mA ／ cm ，時(shí)間 45 ～ 60min 。

3. 染色 關(guān)閉電源后立即將膜取出，放入染色液中浸染 2 ～ 3min ，然后移入漂洗液中漂洗數(shù)次，至蛋白條帶清晰，背景無(wú)色為止。

4. 定量 取試管 6 支，編號(hào)依次為 0 （空白）、 A 、 α1 、 α2 、 β 、 γ ，將電泳圖譜亦按 A 、 α1 、 α2 、 β 、 γ 蛋白區(qū)帶剪開(kāi)，分別裝入相應(yīng)號(hào)碼試管中。再在圖譜兩端無(wú)蛋白部位剪一條寬約 α1 帶的空白帶放入空白管中。各管中加 0.4mol/L NaOH 4ml ，振搖數(shù)次，使染料色澤浸出， 30min 后，在 620nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以空白管校正零點(diǎn)，讀取清蛋白及 α1 、 α2 、 β 及 γ 球蛋白各管的吸光度。

【 計(jì)算】

吸光度總和 T 為各種蛋白吸光度的總和： T = A + α1 + α2 + β + γ 。 分別 按下面算式計(jì)算各組分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)：

清蛋白 (%) ＝ (A/T)×100% α 1 球蛋白 (%) ＝ ( α 1 /T)×100%

α 2 球蛋白 (%) ＝ ( α 2 /T)×100% β 球蛋白 (%) ＝ ( β /T)×100%

γ 球蛋白 (%) ＝ (γ/T)×100%

現(xiàn)在許多實(shí)驗(yàn)室采用光密度計(jì)定量法。待薄膜*干燥后，浸于透明液中約 5 ～ 10min ，取出平貼在玻璃板上，*干燥后成為透明的膜。然后在光密度計(jì)上測(cè)定吸光密度，并可繪制成曲線，或者直接計(jì)算出各種蛋白質(zhì)的百分含量。

【 臨床意義】

1. 參考值

血清蛋白質(zhì)參考值

等電點(diǎn)

分子量

占總蛋白的百分?jǐn)?shù)(%)

清蛋白

α1球蛋白

α2球蛋白

β球蛋白

γ球蛋白

4.64

5.06

5.06

5.12

6.85～7.3

69 000

200 000

300 000

90 000～150 000

156 000～950 000

57～72

2～5

4～9

6.5～12

12～20

2. 臨床意義 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)，供臨床上診斷肝、腎等疾病參考。如腎病綜合癥患者，血漿蛋白中小分子量的白蛋白漏出隨尿液排出體外，導(dǎo)致醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中白蛋白區(qū)帶明顯變小變淺。又如，慢性肝炎和肝硬化患者，由于肝細(xì)胞受損，肝臟合成血漿蛋白質(zhì)的能力大大下降，使血漿白蛋白顯著降低， γ 球蛋白相對(duì)顯著增加。多發(fā)性骨髓瘤患者血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中可見(jiàn)不正常的球蛋白條帶。

【注意事項(xiàng)】

1. 電泳時(shí)，電壓應(yīng)控制在 110 ～ 140V ，不能過(guò)高，若電壓太高，產(chǎn)熱量大，則蛋白質(zhì)標(biāo)本會(huì)破壞，并且電壓高則帶電顆粒移動(dòng)速度快，分離效果不理想。

2. 醋酸纖維素薄膜在電泳前，一定要在緩沖液中浸透，否則有礙電泳分離，是浸泡，效果*。

3. 點(diǎn)樣時(shí)樣品一定要點(diǎn)在無(wú) 光澤面，否則很難吸入，點(diǎn)樣量 不宜過(guò)多（血清樣品zui適宜 3μl ）。其原因是醋酸纖維素薄膜承受蛋白質(zhì)有限。量過(guò)多則分子量相近的物質(zhì)相互爭(zhēng)奪遷移而重疊，影響結(jié)果觀察。

4. 電泳開(kāi)始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進(jìn)行，要先關(guān)閉電源。