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用于豬瘟病毒診斷的高敏配對單抗上市

• 研究背景

豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟病毒在細胞質(zhì)內(nèi)復制,不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關(guān)抗原。該病毒對**敏感，對溫度、紫外線、化學消毒劑等抵抗力較強。

豬瘟病毒能在豬胚或乳豬脾、腎、骨髓、淋巴結(jié)、白血球、結(jié)締組織或者肺組織的細胞中培養(yǎng)，但在這些細胞上不產(chǎn)生明顯病變?？衫秒u新城疫病毒強化試驗（END試驗)測定豬瘟病毒，作為診斷豬瘟的一種方法。

臨床診斷方法有：1.動物接種試驗易感豬接種是檢測豬瘟病毒的敏感方法。采取發(fā)病豬的血液或病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體等組織制成乳劑，無菌處理后接種易感豬（10-20Kg），觀察發(fā)病情況，然后再分離病毒。通常采用兔體交叉免疫試驗。2、檢測血清抗體檢測血清抗體可為豬瘟免疫提供依據(jù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗對檢測非典型豬瘟和溫和性豬瘟有重要作用。3、檢測豬瘟病毒直接免疫熒光抗體技術(shù)是檢測豬瘟病毒的一種快速診斷方法，該方法是采取豬的扁桃體或者豬腎、脾等組織做冰凍切片或觸片，經(jīng)丙酮固定，熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，如果這些組織細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有亮綠色熒光，說明細胞內(nèi)存在豬瘟病毒，即可診為豬瘟。

   應(yīng)市場需要，我們山東綠都生物食品安全檢測事業(yè)部歷時2年時間，開發(fā)了38株抗豬瘟鼠單抗，經(jīng)過配對測試，找出1組可以配對成功，并投入了市場進行臨床驗證。

二，目的意義

1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，指導客戶與有關(guān)監(jiān)督部門考核產(chǎn)品。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測豬瘟病毒。

• 鼠單抗質(zhì)量鑒定

①免疫熒光鑒定

1.ST細胞鋪96孔板一個，同時接毒，按照5%接毒，每孔接50ul。

2.48-120小時測定熒光。用0.01Mpbs洗三次后棄掉pbs，拍干。 3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分鐘，放入-20℃后棄掉上清，不拍板。

4.pbs洗三次，棄上清，不用拍板，吸干水分。

5.加入一抗，按照0.1 mg/ml加入。37℃防置40分鐘，pbs洗三次，吸干水分。

6.加入二抗（按1:40加入，pbs稀釋）37 ℃防置40分鐘。Pbs洗4次，吸干水分，不拍板，觀察。

7.顯微鏡亮度：1.5亮度

注意：1.做不接毒的空白細胞對照。

         2.pbs洗要同一位點加入，要溫柔。

         3.鋪板同步接毒。

②膠體金初步鑒定

 18G4標記金，10A2 劃線組合，測定病毒液1:5稀釋，*。

所開發(fā)試紙條產(chǎn)品顯示： 1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，可以將油佐劑疫苗冷凍破乳化，但不可以用乙醇和二甲基亞砜等使蛋白變性的有機溶劑破乳化。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測豬瘟病毒。

配對情況：10A2-18G4    ，推薦10A2劃線，18G4標記金。

推薦使用濃度： 膠體金： 5微克/ml金液，劃線0.5-1mg/ml

                ELISA： 1：50 000-50 0000

                WB及免疫組化，免疫熒光：1:50-1：500

③ 特異性、符合率、穩(wěn)定性、靈敏度、假陽性率、假陰性率

特異性： 本配對抗體開發(fā)的試紙條產(chǎn)品只識別豬瘟病毒,與其他病毒無交叉反應(yīng)。

符合率：本試紙條與PCR符合率99%。

穩(wěn)定性:  本試紙條常溫的保質(zhì)期為36個月。

靈敏度： 不低于PCR的靈敏度。

假陽性率： <5%

假陰性率:   0%

四、配套羊抗鼠二抗與萬能C線反應(yīng)蛋白； CSFV純化標準陽性 抗原。

五、產(chǎn)品說明書附錄

生產(chǎn)公司：山東綠都生物科技有限公司

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