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一、原理

替米考星ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中替米考星的殘留量。

二、適用范圍

定量檢測組織樣本中替米考星殘留。

三、替米考星ELISA檢測試劑盒特點及技術(shù)指標(biāo)

* 檢 測 時 間 ： 30min

  試劑盒靈敏度： 0.1ppb(µg/kg)

* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜0.04ppb；

* 樣品處理方法簡潔，符合率大于95%；

試劑盒檢測樣本的靈敏度和準確度：

試劑盒交叉反應(yīng)率：

四、所需材料

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450 nm/630 nm、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）

微量移液器：單道 1µL～10 µL、10 µL～100µL

多道 50µL～300µL

試劑：去離子水、乙腈

五、 試劑盒組成

*注：5個標(biāo)準品A、B、C、D、E濃度分別為：0 ppb, 0.1 ppb, 0.3 ppb, 0.9 ppb, 2.7 ppb，A、B各1 mL，C、D、E各0.5 mL，直接使用。

六、溶液配制

配液1: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積比進行稀釋，用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。

配液2:  1 ×替米考星樣品稀釋液    

用去離子水將2×替米考星樣品稀釋液按1:1體積比進行稀釋。配好的1×替米考星樣品稀釋液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。

配液3:  1 ×替米考星樣品提取液    

用去離子水將10×替米考星樣品提取液按9:1體積比進行稀釋。配好的1×替米考星樣品提取液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。

七、樣本前處理                                                   

樣本處理前須知：

① 處理完的樣品應(yīng)及時進行下步檢測，實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。② 樣本數(shù)目超過8個時推薦使用排槍加樣。

組織（稀釋倍數(shù)：100)

• 稱取糊狀樣品1.0g ± 0.05g至50mL離心管中，加入2mL 1×替米考星樣品提取液， 震蕩提取1min；
• 再加入2 mL乙腈，震蕩提取1min；
• 4000rpm離心5min.；
• 小心取出上層溶液50μL至另一裝有950μL 1×替米考星樣品稀釋液的離心管中，震蕩混勻，取50μL用于分析。

八、 酶標(biāo)免疫測定程序

• 將所有所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其*回升至室溫后方可使用，根據(jù)體積大小不同取出回溫的時間從1小時~2小時。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
•  按標(biāo)準品和樣品雙孔平行的數(shù)量使用微孔。
•  加標(biāo)準品/樣品、酶、抗體：加標(biāo)準品/樣品50µL到對應(yīng)的微孔中，加入替米考星酶標(biāo)物50µL/孔，加入替米考星抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min。
•  洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，

加入洗滌工作液300 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

•  顯色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物    

   液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜             

     蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。

• 測定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即  測定450/630nm處的吸光度值。

九、 結(jié)果判定

以標(biāo)準品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以替米考星標(biāo)準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中替米考星實際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件，以便進行大量樣本的分析計算。）

十、 注意事項

① 根據(jù)體積大小不同取出回溫的時間從1 h~3 h，體積15 mL以上的先從冷藏環(huán)境取出回溫，

② 洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

③ 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

④ 不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑。

⑤ 0標(biāo)準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

⑥ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色    時間為15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20min，反之則減短反應(yīng)時間。

⑦ 底物液B液長期使用變?yōu)闇\藍色時，請放心使用，不影響檢測結(jié)果。

十一、貯藏條件及保存期

    貯藏條件： 2～8℃

保 質(zhì) 期： 12個月