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一、原理
四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法定量檢測樣品中四環(huán)素類的殘留量。
二、適用范圍
定量檢測組織、蜂蜜、牛奶樣本中四環(huán)素類殘留。
三、四環(huán)素類ELISA檢測試劑盒特點及技術指標
* 檢 測 時 間 ： 40min
試劑盒靈敏度： 0.1ppb(µg/kg)
* 試劑盒檢測純陰性樣本的背景值＜1ppb；
* 樣品直接稀釋用于檢測，結果準確；
* 試劑盒提供近工作濃度標準品，使用更方便。
試劑盒檢測樣本的靈敏度和準確度：
樣本 | 檢測下限 | 回收率 |
蜂蜜 | 3ppb | 70%-120% |
組織 | 4ppb | 70%-120% |
牛奶 | 0.1ppb | 70%-120% |
試劑盒特異性：
藥物名稱 | 交叉反應率（%） |
四環(huán)素 | * |
土霉素 | 82% |
金霉素 | 73% |
四、所需材料
儀器：微孔板酶標儀450 nm/630 nm、均質器、振蕩器、離心機、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）
微量移液器：單道 1µL～10 µL、10 µL～100µL
多道 50µL～300µL
試劑：去離子水
五、 試劑盒組成
序號 | 組成部分 | 96T裝量 |
1 | 四環(huán)素酶標板 | 12×8孔 |
2 | 50×四環(huán)素標準品*5 | 5×0.5mL |
3 | 四環(huán)素類酶標物 | 7 mL |
4 | 四環(huán)素類抗體 | 7mL |
5 | 底物液A液 | 7 mL |
6 | 底物液B液 | 7 mL |
7 | 終 止 液 | 7 mL |
8 | 20×濃縮洗滌液 | 40 mL |
9 | 四環(huán)素標品稀釋液 | 30mL |
10 | 10×四環(huán)素樣品稀釋液 | 10mL |
11 | 10×四環(huán)素提取液 | 30mL |
*注：A、B、C、D、E5個標準品濃度為：0 ppb, 5 ppb,15 ppb, 45ppb, 135ppb，稀釋50倍使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，配后避光放置并于半小時內使用，具體見溶液配制。
六、溶液配制
配液1: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積比進行稀釋，用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。
配液2: 1×四環(huán)素樣品稀釋液
用去離子水將10×四環(huán)素樣品稀釋液按1: 9的體積比進行稀釋，用于樣本的稀釋，1×四環(huán)素稀釋液在4℃環(huán)境可保存一個月，用前一天取出回溫。
配液3: 1×四環(huán)素提取液
用去離子水將10×四環(huán)素提取液按1: 9的 體積比進行稀釋，用于樣本的提取，1×四環(huán)素提取液在室溫環(huán)境可保存一個月。
配液4: 四環(huán)素工作濃度標準品
50×四環(huán)素標 準品 | 四環(huán)素標品稀 釋液 | 工作濃度標 準品 |
0 ppb 10 µL | +490 µL | 0 ppb |
5 ppb 10 µL | +490 µL | 0.1 ppb |
15 ppb 10 µL | +490 µL | 0.3 ppb |
45 ppb 10 µL | +490 µL | 0.9 ppb |
135 ppb 10 µL | +490 µL | 2.7 ppb |
七、樣本前處理
樣本處理前須知：
① 處理完的樣品應及時進行下步檢測，實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。② 樣本數(shù)目超過8個時推薦使用排槍加樣。
（一）蜂蜜 （原蜜、成品蜜，稀釋倍數(shù)：30）
① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至7mL離心管中，加 入2mL 去離子水，震蕩使其溶解（若渾濁需離心）；
② 取出50μL清亮液體，加到450μL 去離子水中，混勻，取50μL直接用于分析。
（二）豬肉、魚蝦、雞肉（稀釋倍數(shù)：40）
① 稱取樣品1.0g ± 0.05g至50mL離心管中，加 入3mL 1×四環(huán)素提取液，震蕩提取2-3min；
② 4000rpm離心5min；
③ 取50μL上清液加到450μL1×四環(huán)素樣品稀釋液，混勻，取50μL用于分析。
（三）生鮮奶（稀釋倍數(shù)：1）
取新鮮無變質的生奶，取適量回溫后直接用于分析。
八、 酶標免疫測定程序
加入洗滌工作液250 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
九、 結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以四環(huán)素類標準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素類實際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件，以便進行大量樣本的分析計算。）
十、 注意事項
① 根據(jù)體積大小不同取出回溫的時間從1小時~2小時，體積15毫升以上的先從冷藏環(huán)境取出回溫。
② 50*四環(huán)素標品使用完畢后請及時放回冰箱避光保存。
③ 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
④不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號的試劑。
⑤ 0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。
⑥ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色 時間為15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min，反之則減短反應時間。
⑦ 底物液B液長期使用變?yōu)闇\藍色時，請放心使用，不影響檢測結果。
⑧ 未提及樣本請致電本公司技術服務部。
十一、貯藏條件及保存期
貯藏條件： 2～8℃
保 質 期： 12個月
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