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懷菊花中活性物質的閃式提取與HPLC測定
懷菊花中活性物質的閃式提取與HPLC測定
王夏青 1，劉延澤2，盧付軍2，鄭秀明2，趙余慶3*
（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.河南金鼐科技發展有限公司，河南 鄭州 450016；
3.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016）
摘要 本文采用閃式技術對懷菊花活性物質綠原酸進行了提取工藝的比較（超聲及藥典法）和HPLC檢測，優選了懷菊花的閃式提取工藝。
關鍵詞 懷菊花；閃式提取；HPLC
菊花為常用傳統中藥，來源于菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序。其味甘苦,性涼，具有散風清熱，平肝明目之功效。主要用于風熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花等癥[1]。菊花的有效成分為綠原酸和黃酮類，綠原酸已經被證明有抗菌和抗炎作用。2005年版中國藥典采用HPLC法測定綠原酸的含量作為菊花質量的內控指標[2]。
閃式提取技術是一種利用閃式提取器對于植物軟、硬材料快速提取的新型提取技術。由于完成一次提取一般在1-3分鐘左右，比傳統方法更快速、簡便，故被稱之為閃式提取。其原理是依靠機械剪切力和超動分子滲濾技術，在室溫及溶劑存在下數秒鐘內將植物的根、莖、葉、花、果實等物料破碎至細微顆粒，并使有效成分迅速達到組織內外平衡，通過過濾達到提取的目的。閃式提取技術能夠避免植物有效成分受熱破壞，具有溶劑用量小，提取時間短，效率高等特點[3]，是一種新興的中藥現代化提取關鍵技術。
本研究以菊花中綠原酸為檢測指標，對懷菊花進行傳統提取方法及閃式提取法的比較，并依據藥典及文獻方法對其中的綠原酸進行了HPLC測定，優選出懷菊花中綠原酸提取的*工藝。
1 實驗部分
1.1 實驗材料
綠原酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，編號：110753-200413）；懷菊花購于河南；甲醇為色譜純；磷酸為色譜純；磷酸二氫鈉為色譜純；水為雙蒸水。
1.2 儀器
閃式提取器JHBE-50S（河南金鼐科技發展有限公司）；精密電子天平BS-124S(德國賽多利斯公司)；旋轉蒸發儀RE-52A（上海亞榮盛華儀器廠）；恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；數控超聲波清洗器KQ3200DB（昆山市超聲儀器有限公司）；北京創維液相色譜儀（UV3000紫外檢測器和色譜柱恒溫箱）；CXTH-3000色譜工作站；色譜柱Kromasil C18不銹鋼柱(4.6×250mm)。
1.3 色譜條件及試樣制備
1.3.1色譜條件
流動相為磷酸二氫鈉緩沖溶液：甲醇（70：30）（取磷酸二氫鈉15.6 g加水至1000 mL，制成0.1 mol·L-1的溶液，加入磷酸適量，使pH值為2.7；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長328 nm。
1.3.2標準溶液配制
取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加水制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。
樣品溶液制備
1.3.3試樣制備
基金項目：遼寧省天然藥物現代分離與工業化制備工程技術研究中心（2006-19-10）
*通訊作者：： , : zyq4885
1.3.3.1回流提取法:
取本品粉末（過一號篩）精稱1 g置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，回流2h，放冷，補充損失的甲醇量，搖勻，濾過，濃縮至近干，殘渣用氯仿5 mL浸漬3分鐘，棄去氯仿液，殘渣揮去氯仿，加水適量使溶解，并轉移至1 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。
1.3.3.2超聲提取法
取干燥的樣品適量1 g，精密加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷,補充損失的甲醇量，搖勻，濾過，濃縮至近干，殘渣用氯仿5 mL浸漬3分鐘，棄去氯仿液，殘渣揮去氯仿，加水適量使溶解，并轉移至1 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。
1.3.3.3閃式提取法
考察三因素三水平，提取時間（A），A1=1 min，A2=2 min，A3=3 min；提取次數（B），B1=1次，B2=2次，B3=3次；液料比（C），C1=30:1，C2=50:1，C3=70:1。
1.3.4線性關系考察
精密吸取綠原酸對照品溶液0.1，0.2，0.4，1，2 μL，進行測定。以峰面積為橫坐標，含量為縱坐標作圖標準曲線如圖1所示。其回歸方程為：y = 40.023x + 1.6465，r=0.9998。結果表明，綠原酸在0.1 μg～2 μg范圍內，進樣量與峰面積之間線性關系良好。
1.3.5精密度試驗
精密吸取菊花閃提9號樣品10μL 同時進樣3次，測定含量，記錄綠原酸峰面積，計算RSD％為2.24%，表明此標準曲線具有高的精密度。
1.3.6穩定性試驗
精密吸取閃提9號樣品按0，2，4，6，8 h進樣5次，記錄峰面積，計算平均值，計算RSD％為2.62%，表明此方法在8 h內穩定性良好。
1.3.7重現性試驗
取樣品4 g，按閃提法制備9號樣品的方法，平行制備5份供試品溶液，測定含量，記錄峰面積積分值，計算RSD％為1.52%，表明本方法重現性良好。
1.3.8加樣回收率試驗
精密稱定已知含量的菊花，加入一定量的綠原酸對照品，吸取一定量，按上述條件測定峰面積，按照標準曲線計算綠原酸對照品的量，RSD％為1.67%。
2 結果與討論
2.1 結果
菊花閃提*工藝為料液比（30：1）提3分鐘提3次 含量1.62%
表2-1菊花不同提取方法，提取物中綠原酸的含量（%）
提取方法 | 綠原酸的含量（%） |
回流提取 | 0.98 |
超聲提取 | 0.82 |
閃式提取 | 1.62 |
2.2 討論
利用閃式提取法提取懷菊花的有效成分，獲得了較高提取率的綠原酸。其含量約為回流和超聲提取法的2倍。可見閃式提取法顯示出與藥典記載方法和超聲法相比較具有多方面的優勢。
首先，閃式提取器提取法具有提取時間短的優點，僅需幾分鐘，便可以達到率的快速提取，節省時間和能源，這是其它提取法無法實現的。
其次，傳統的提取方法一般需要長時間加熱提取，不利于一些熱敏性物質的穩定存在。而閃式提取器提取是在常溫下進行的，對于藥材中有效成分的破壞極小，更適合于熱敏性物質的提取。
綜上所述，閃式提取法是一種更為、節能、安全的全新的提取技術。
參考文獻
[1] 周志祥，魏俊德. 液相色譜法測定菊花中綠原酸含量的方法改進. .時珍國醫國藥，2006，17(11)：:2221-2222
[2] 劉曉芳，馬新玉，周鋼. 中國藥典菊花綠原酸含量測定方法的探討. .新疆中醫藥，2006，,24(5)：78-79
[3] 劉延澤. 植物組織破碎提取法及閃式提取器的創制與實踐. 中國天然藥物，2007，5(6)：401-407.