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多色流式實驗熒光素的選擇
流式細胞儀已經成為臨床醫生、免疫學家和細胞生物學家*的工具，這項技術在不斷進步。流式細胞儀的多參數細胞分析這一*的功能讓大多數細胞分析成為了可能。Coon首先提出了熒光抗體標記細胞內的目的蛋白技術，在20世紀80年代，細胞亞群僅僅通過檢測單一的細胞表面標志物來確定，使用的單抗和熒光素很受限制。基因表達技術的誕生和新的單抗以及熒光素的獲得使更復雜的多參數分析成為可能。
1. 常用熒光素的種類及特性
1）. FITC（Fluorescein）又稱異硫氰酸熒光素，其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；FITC 的zui大發射波長為525nm，在流式細胞儀的FL1通道檢測。
2). PE（R-Phycoerythrin）又稱藻紅蛋白，有R-PE和RD1的別稱，其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；PE 的zui大發射波長為575nm，在流式細胞儀的FL2通道檢測。
3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed（TR）組合而成的Tandem熒光素；其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；PE-TR的zui大發射波長為 615nm，在流式細胞儀的FL3通道檢測；PE-TR標記的抗體可用于毫瓦級激光器的小流式細胞儀，也適用于配備有全功率激光器的大流式分選儀。
4). PI（PropidiumIodide）又稱碘化丙啶，其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；PI的zui大發射波長為617nm。在流式細胞儀的FL3通道檢測。
5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）又稱TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5組合而成的Tandem熒光素；其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；PE-Cy5 的zui大發射波長為670nm，在流式細胞儀上用FL3通道檢測；PE-Cy5 標記的抗體可用于毫瓦級激光器的小流式細胞儀，也適用于配備有全功率激光器的大流式分選儀。
6). PerCP（Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex）多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物，其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；PerCP的zui大發射波長為677nm。在流式細胞儀的FL3通道檢測。
7). APC（Allophycocyanin）又稱別藻藍蛋白，其標記的抗體適用于配備氦氖激光器發射波長為633nm的多色流式細胞儀；APCzui大發射波長為660nm，在流式細胞儀中只有配有雙激光器的FL4才能檢測。
8). APC-Cy7是由APC 和Cy7組合而成的Tandem熒光素；其標記的抗體適用于配備氦氖激光器發射波長為633nm的多色流式細胞儀，APC-Cy7主要用于四色以上的流式細胞術。
2. 常見熒光素熒光強度比較
熒光的強度與染色指數(Stain Index)有關，染色指數的計算：Stain Index=D/W，染色指數越高，熒光強度越好；染色指數較低，染色強度相對較差：
通過染色指數可以看出各個熒光素的強度：PE>APC>FITC>PerCP
3. 多色流式細胞檢測中熒光素選擇的原則
a). 根據機器配置選擇熒光素 比如 BD calibour 流式儀，配置有兩色激光，能夠做 4 個通道的熒光素，需根據對應的激光激發波長和檢測通道選擇合適的熒光抗體
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多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur 常用的四色搭配：FITC, PE, PerCP, APC
b). 根據抗原表達強弱合理分配熒光素 明確檢測指標的表達情況，可將其分為三個層次：
*層次抗原：這一類抗原通常表達穩定且大多呈高表達狀態。如果該類抗原為高表達的話，可以將其與熒光強度較低的熒光素抗體相結合，如 Alexa Fluor 700，Brilliant Violet570TM，Brilliant Violet 785 TM 或 APC-Cy7。
第二層次抗原：這類抗原對于進一步表型鑒定至關重要，但是在平行實驗中表達量也會有所變化。該類抗原表達水平多變，通常適合與中度熒光強度的熒光素抗體結合，如 Brilliant Violet 510TM，Brilliant Violet 650TM，FITC 或 PerCP-Cy5.5。
第三層次抗原：這類抗原有可能在不同樣本中表達差異很大甚至表達量未知。通常針對這類抗原市面上只有純化抗體，且其搭配的熒光素類型也較少。對于這類抗原的檢測要盡量選擇熒光素強度zui強的熒光素抗體，如 Brilliant Violet 421TM，PE，APC 或 PE-Cy7。
c). 選擇光譜重疊小的熒光素 由于熒光素的寬發射譜的特點，熒光通道間有光譜重疊現象，因此選擇試劑組合時要將光譜疊加可能性減到zui低。多色流式實驗的時候需要通過補償調節消除光譜重疊的影響。比如 FITC和 PE，FITC 的發射譜是 530/30，PE的發射譜是 585/42，部分發生重疊。如在進行四色分析，經常會將 PE-Cy5標記的抗體與 APC 標記的抗體搭配使用，此搭配需較大幅度地調節兩者的顏色補償。可選用 PE-Cy5.5 來替代 PE-Cy5，顏色補償只需 1% 左右。因為 Cy5的激發波長與 APC 的激發波長相近，所以 PE-Cy5 熒光素中的 Cy5，也會被激發 APC 的第二個激光器（氦氖激光器）所激發，導致 PE-Cy5 與 APC 的顏色補償很難調。相反，PE-Cy5.5 中的 Cy5.5 激發波長為675nm，不能被激發 APC 的第二個激光器所激發，也就不存在 Cy5.5 對 APC的干擾，顏色補償也就很小。因此，可能需要犧牲個別的熒光的亮度來避免熒光滲漏以及敏感度喪失。 
要通過單標對照進行補償調節：
所以盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如 FITC/PE-Cy7;
選擇不同激光激發的熒光素，如 FITC/APC, PE/APC。
d). 盡量避免偶聯染料使用帶來的假陽性 偶聯熒光染料是指兩種熒光素聯接在一起進行熒光共振能量轉移。供方熒光素如 PE，APC 或 Brilliant Violet 421TM 被激光激發，然后通過共振將能量轉移給受體熒光素，如 PE-Cy7 中的 Cy7。若使用偶聯的熒光素，務必要在短時間內盡快完成實驗，曝光時間越長，熒光素就越不穩定。 