在正畸治療中，牙齒移動時，牙槽骨的張力側(cè)和壓力側(cè)分別發(fā)生骨形成和骨吸收。張力在牙周韌帶 (PDL)  細(xì)胞中被轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)信號，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化活性，從而上調(diào)骨相關(guān)基因的表達(dá)。分化的成骨細(xì)胞分泌骨外基質(zhì)，如骨橋蛋白 (Opn) 和骨鈣素 (Ocn)，導(dǎo)致在PDL附近的牙槽骨表面形成新骨。值得注意的是，雖然在正畸牙齒移動過程中，張力側(cè)的骨形成活動受到刺激，但PDL本身并沒有骨化，并維持其穩(wěn)態(tài)，這表明在PDL中有負(fù)調(diào)控骨形成的因子。

Scleraxis (Scx) 是一種基本的螺旋轉(zhuǎn)錄因子，主要在肌腱中表達(dá)，被認(rèn)為對肌腱發(fā)育至關(guān)重要。在小鼠實(shí)驗性牙齒移動模型中，機(jī)械應(yīng)力加載后 2 天后，PDL 張力側(cè)的 Scx 表達(dá)上調(diào)。此外，在培養(yǎng)的 PDL 細(xì)胞中的 Scx 過表達(dá)在成骨條件下下調(diào) Opn 和 Ocn 的表達(dá)和礦化，而對 Osx 的表達(dá)沒有顯著影響。這些結(jié)果表明，Scx 通過抵消 Osx 的成骨活性來抑制鈣化細(xì)胞外基質(zhì)的形成，從而在張力側(cè)對 PDL 的骨化具有抑制作用。然而，在受到張力的PDL 中 Scx 調(diào)節(jié)的骨化抑制的分子生物學(xué)機(jī)制尚不*清楚。

基于此，來自日本京都大學(xué)、廣島大學(xué)、鶴見大學(xué)等高校的專家學(xué)者進(jìn)行了合作研究，目的是闡明Scx在張力誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞成骨分化中的抑制作用及其潛在機(jī)制。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Bone 題為《Scleraxis upregulated by transforming growth factor-β1 signaling inhibits tension-induced osteoblast differentiation of priodontal ligament cells via ephrin A2》。

實(shí)驗結(jié)果

1.在實(shí)驗性牙齒移動模型中，Scx 的表達(dá)在 PDL 對張力的早期響應(yīng)期間增加

使用細(xì)胞拉伸系統(tǒng)產(chǎn)生12% 的拉力加載到PDL細(xì)胞上3或6小時，在對照組中，PDL細(xì)胞在不施加拉力的拉伸室中培養(yǎng)。

組織學(xué)分析表明，在機(jī)械應(yīng)力加載后 6 小時，PDL 間隙變寬，張力側(cè)成纖維細(xì)胞伸長。在壓力側(cè)，PDL空間變窄，細(xì)胞在實(shí)驗期間被壓縮。

然后實(shí)驗分析 Scx在PDL對機(jī)械應(yīng)力早期反應(yīng)中的表達(dá)。之前的報告表明 Scx 在整個 PDL 中廣泛表達(dá)。因此，為了量化 Scx 表達(dá)的增加，評估了Scx^high  與 Scx⁺ 細(xì)胞的比例。在張力側(cè)，與對照組相比，牙齒移動（TM）組的比例在3和6小時顯著增加。在壓力側(cè)，TM組在3、6 h時比例下降，6 h時，對照組和TM組之間有顯著差異。

2.在體外加載張力的 PDL 細(xì)胞中，敲低Scx 上調(diào)堿性磷酸酶 (ALP) 的表達(dá)

實(shí)驗建立了人PDL細(xì)胞體外牽張力加載實(shí)驗系統(tǒng)。PDL細(xì)胞中Scx表達(dá)在拉力加載后3和6 h顯著增加。通過在 PDL 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染靶向 Scx 的siRNA來敲低Scx，然后加載張力，分析張力誘導(dǎo)的 Scx 在PDL 細(xì)胞成骨分化中的作用。

在對照siRNA轉(zhuǎn)染組中，張力顯著上調(diào)Scx表達(dá)。在張力負(fù)荷下，Scx siRNA轉(zhuǎn)染組Scx表達(dá)顯著低于對照siRNA轉(zhuǎn)染組，其表達(dá)水平與未加載的對照 siRNA 轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平相當(dāng)。

為了評估在Scx敲低和不敲低情況下，張力負(fù)載的 PDL 細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，實(shí)驗分析了 ALP 的表達(dá)，ALP 被稱為早期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物。在對照siRNA轉(zhuǎn)染組中，張力顯著誘導(dǎo)ALP表達(dá) 。在張力負(fù)荷下，Scx siRNA轉(zhuǎn)染組中ALP的表達(dá)水平顯著高于對照siRNA轉(zhuǎn)染組。

3.張力激活的 TGF-β1-Smad3 信號通路上調(diào) PDL 細(xì)胞中的 Scx 表達(dá)

接下來檢測了 TGF-β1 信號是否影響 PDL 中的 Scx 表達(dá)以響應(yīng)張力。與 PDL 張力側(cè)的 0 和1h 相比，TGF-β1 表達(dá)在 3 和 6 h被激活。在壓力側(cè)TGF-β1 表達(dá)沒有顯著變化。

此外，定量分析實(shí)驗牙齒移動中 PDL 早期反應(yīng)期間 p-Smad3 的表達(dá)。在PDL的張力側(cè)，與對照組相比，TM組中p-Smad3⁺ 細(xì)胞與Scx⁺ 細(xì)胞的比例在3和6小時顯著增加。在 PDL 的壓力側(cè)，TM 組中的比例在實(shí)驗期間沒有明顯變化。

這些數(shù)據(jù)表明，在 PDL 對張力的早期反應(yīng)期間，張力激活了 TGF-β1-Smad3 信號通路。

下面進(jìn)一步分析了由張力激活的 TGF-β1-Smad3 信號在體外刺激PDL細(xì)胞Scx表達(dá)。PDL細(xì)胞中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)在張力加載后3 h顯著上調(diào) 。然后檢測了TGF-β 受體抑制劑 SB-431542 、Smad3特異性抑制劑SIS3對張力誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞Scx表達(dá)的影響。5 μM SB-431542 和50 μM SIS3 處理顯著抑制了PDL 細(xì)胞中張力誘導(dǎo)的Scx表達(dá)。

4.Scx 上調(diào) Efna2 ，在張力負(fù)荷下負(fù)調(diào)控 PDL 中 ALP 的表達(dá)

實(shí)驗研究了 Efna2 是否與 Scx 調(diào)節(jié)的對 PDL 細(xì)胞張力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化的抑制有關(guān)。敲低Efna2 檢查了張力誘導(dǎo)的 Efna2 對 PDL 細(xì)胞成骨分化的影響。Efna2敲低抑制了PDL細(xì)胞中張力誘導(dǎo)的Efna2表達(dá)。在對照siRNA轉(zhuǎn)染組中，張力顯著上調(diào)ALP表達(dá)。在張力負(fù)荷下，與對照 siRNA 轉(zhuǎn)染組相比，Efna2 siRNA 轉(zhuǎn)染組的 PDL 細(xì)胞中 ALP 的表達(dá)顯著增加。

此外，在 PDL 細(xì)胞中敲低 Scx，然后加載張力，以分析 Scx 在張力誘導(dǎo)的 Efna2 表達(dá)中的作用。張力誘導(dǎo)了對照siRNA轉(zhuǎn)染組Efna2的表達(dá)，而Scx siRNA轉(zhuǎn)染組的Efna2在張力加載下顯著低于對照siRNA轉(zhuǎn)染組，且與未加載組相當(dāng) 。

實(shí)驗結(jié)論

綜上所述，該研究揭示了Scx在PDL細(xì)胞對張力的早期反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)。張力誘導(dǎo)的 Scx 抑制PDL 細(xì)胞的成骨分化。此外，TGF-β1-Smad3 信號通路和 Efna2 分別是 Scx 的上游和下游調(diào)控因子，以響應(yīng) PDL 細(xì)胞對張力的反應(yīng)。研究結(jié)果表明，TGF-β1-Scx-Efna2 軸是一種新的分子機(jī)制，可負(fù)向調(diào)控張力誘導(dǎo)的 PDL 細(xì)胞成骨分化。這種機(jī)制可能有助于在生理和正畸牙齒移動過程中抑制 PDL 的骨化和維持 PDL的穩(wěn)態(tài)。

參考文獻(xiàn)：Kawatsu M, Takeshita N, Takimoto A, Yoshimoto Y, Seiryu M, Ito A, Kimura S, Kawamoto T, Hiraki Y, Shukunami C, Takano-Yamamoto T. Scleraxis upregulated by transforming growth factor-β1 signaling inhibits tension-induced osteoblast differentiation of priodontal ligament cells via ephrin A2. Bone. 2021 Aug;149:115969. doi: 10.1016/j.bone.2021.115969. Epub 2021 Apr 21. PMID: 33892176.

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