血流紊亂所引起的剪切應(yīng)力降低，將會(huì)損害內(nèi)皮完整性，促進(jìn)血管炎癥病變的發(fā)展。今天，和大家分享的實(shí)驗(yàn)是金屬蛋白酶ADAM15在剪切應(yīng)力作用下上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活。

小編分享的內(nèi)容主要來(lái)自國(guó)外的一篇名為《The metalloproteinase ADAM15 is upregulated by shear stress and promotes survival of endothelial cells》的研究報(bào)告。

ADAM家族的金屬蛋白酶已參與細(xì)胞存活和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到生理剪切應(yīng)力時(shí)，ADAM家族內(nèi)ADAM15mRNA上調(diào)(4倍)。這種誘導(dǎo)作用在靜脈、動(dòng)脈和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中得到證實(shí)，并與ADAM15蛋白在細(xì)胞裂解液中(5.6倍)和細(xì)胞表面(3.1倍)的表達(dá)增加有關(guān)。ADAM15啟動(dòng)子含有轉(zhuǎn)錄因子KLF2的多個(gè)一致位點(diǎn)，也受到剪切應(yīng)力的上調(diào)。

研究介紹

內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露于血流，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮表面層流剪切應(yīng)力。

內(nèi)皮表面的剪切應(yīng)力在大動(dòng)脈和小動(dòng)脈或靜脈中明顯不同。

內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管系統(tǒng)中流動(dòng)條件減少的病理反應(yīng)與轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)。

解整合素和ADAM（金屬蛋白酶）家族成員與各種內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法

慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)：使用MISSION®shRNA進(jìn)行系統(tǒng)短發(fā)夾RNA的慢性病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于ADAM15敲低。并對(duì)pLKO.1puro質(zhì)粒進(jìn)行編號(hào)。

流式細(xì)胞分析：以添加0.2% BSA的PBS作為檢測(cè)緩沖液染色過(guò)程的步驟在4°C下進(jìn)行。HUVECs是通過(guò)小鼠孵育分析ADAM15的表達(dá)抗ADAM15單克隆抗體(5 μg/ml)與apc偶聯(lián)的抗小鼠抗體(1:200)。

細(xì)胞凋亡測(cè)定：10ng /ml TNF和10ng /ml TNF均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用無(wú)血清培養(yǎng)基去除生長(zhǎng)因子培養(yǎng)24小時(shí)，然后用三種不同的方法確定Tosis。對(duì)最終點(diǎn)分析，對(duì)于live-cell成像后，細(xì)胞用fitc標(biāo)記的annexin V在Hanks中孵育緩沖鹽溶液(HBSS)， 30分鐘以綠色熒光區(qū)域的比例確定相對(duì)凋亡和總的細(xì)胞面積在至少8個(gè)圖像為每一條件使用。

總結(jié)

1.剪切應(yīng)力上調(diào)內(nèi)皮ADAM15表達(dá)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在靜態(tài)或者不同流動(dòng)條件下培養(yǎng)。在流動(dòng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞獲得了細(xì)長(zhǎng)的形狀并在流動(dòng)方向上對(duì)齊。

2.流體剪切應(yīng)力引起的ADAM15上調(diào)涉及KLF2。

轉(zhuǎn)錄因子KLF2受剪應(yīng)力誘導(dǎo)，負(fù)責(zé)調(diào)控大部分剪切應(yīng)力敏感基因，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，KLF2mRNA的表達(dá)是通過(guò)剪切應(yīng)力調(diào)控的。

3.ADAM15缺失時(shí)炎癥基因誘導(dǎo)和凋亡增強(qiáng)。

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