蛋白尿是糖尿病腎病（DKD）發展的獨立危險因素，可直接導致腎損傷。多項研究表明減少蛋白尿可延緩終末期腎病的發展，然而，這些方法仍然不能令人滿意。

重吸收尿白蛋白的腎小管上皮細胞可以釋放趨化因子誘導免疫細胞，導致腎損傷。巨噬細胞是腎組織中最重要的免疫細胞類型，可誘導腎纖維化。研究發現，腎巨噬細胞表達纖維化基因，可導致腎纖維化。由于巨噬細胞在疾病進展過程中起著復雜的作用，因此需要進一步探索其在DKD中的作用機制。

研究表明，損傷刺激下巨噬細胞的代謝變化與腫瘤細胞中的相似。刺激后，巨噬細胞引起糖酵解途徑的大量激活，其特征在于葡萄糖消耗增加，乳酸合成和糖酵解。最近的研究表明，巨噬細胞的兩種表型都表現出糖酵解活化增加。

腎小管上皮細胞和巨噬細胞之間的串擾是調節巨噬細胞功能的關鍵。新出現的證據表明，細胞外囊泡（EV）介導信息從腎小管上皮細胞到巨噬細胞的轉移。之前發現白蛋白可以通過EVs促進巨噬細胞M1極化。因此，腎小管上皮細胞衍生的EVs也可能影響巨噬細胞代謝狀態。

目前，DKD期間腎巨噬細胞的代謝狀態尚不清楚。研究發現高血糖可以上調骨髓來源的巨噬細胞糖酵解。然而，被腎小管上皮細胞重吸收的白蛋白是否可以通過EVs影響巨噬細胞的代謝狀態尚不清楚。南方醫院內分泌代謝科、深圳市人民醫院內分泌科、中山大學附屬第五醫院內分泌科的聯合課題組研究了人血清白蛋白（HSA）對DKD期間腎巨噬細胞代謝狀態的影響及其潛在機制。

糖尿病腎巨噬細胞中糖酵解增加

為了探索DKD期間腎巨噬細胞的代謝狀態，使用2型糖尿病模型db/db小鼠，與非糖尿病db/m小鼠相比，通過qRT-PCR（圖1 A）和免疫組化染色（圖1 B）顯示，db/db小鼠纖維化（FN，α-SMA和Col-I）和炎癥（IL-6）標志物的表達增強。

為了探索DKD期間腎巨噬細胞的代謝狀態和功能，分離了小鼠腎巨噬細胞，發現db/db小鼠中的GLUT1，HK2和LDHA mRNA表達顯著增加，與db/m小鼠相比（圖1 C）。免疫熒光表明，db/db小鼠腎臟F4/80巨噬細胞中的GLUT1水平要高得多（圖1 D）。此外，發現 db/db小鼠的腎巨噬細胞中IL1β和TGF-β1 mRNA水平升高（圖1 C）。這些事實表明，DKD小鼠腎巨噬細胞中糖酵解增強。

圖1   糖尿病腎巨噬細胞中糖酵解增加。

HSA處理的腎小管上皮細胞促進巨噬細胞糖酵解

蛋白尿是DKD進展的關鍵，過量的白蛋白通過腎小管上皮細胞影響巨噬細胞。為了進一步探索白蛋白處理的腎小管上皮細胞是否也會影響巨噬細胞代謝狀態，實驗測量了糖酵解酶的表達。巨噬細胞與HSA處理的腎小管上皮細胞（HK-2）共培養大大增強了mRNA水平的GLUT1，HK2和LDHA表達。在巨噬細胞中，HK2和LDHA的蛋白質表達變化與其mRNA表達的變化平行。此外還發現，在與HSA處理的HK-2細胞共培養后，巨噬細胞上清液中的乳酸水平顯著升高。

在之前的研究中，發現HSA處理的腎小管上皮細胞通過EVs影響巨噬細胞表型。接下來進一步探索EVs在巨噬細胞糖酵解中是否是需要的，實驗抑制了HK-2細胞衍生的EVs分泌，然后將這些細胞與巨噬細胞共培養。結果發現表明，HSA刺激的腎小管上皮細胞通過EVs影響巨噬細胞的糖酵解。

HSA處理的腎小管上皮細胞衍生的EVs促進巨噬細胞糖酵解

研究進一步證實，腎小管上皮細胞衍生的EVs會影響巨噬細胞代謝狀態。因此，分離了這些EVs，并通過透射電子顯微鏡（圖2 A）和納米顆粒跟蹤分析（圖2 B）表征了它們的形態和性質。為了探索EVs是否可以被巨噬細胞內化，將Dil-C18標記的EVs與巨噬細胞共培養。結果發現，24 h 后，EVs（紅色熒光）與巨噬細胞共定位（圖2 C）。然后，將巨噬細胞和HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs共培養，發現巨噬細胞中的糖酵解酶增加（圖2 D-F）。與HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs共培養的巨噬細胞上清液乳酸水平（圖2 G） 和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA 水平（圖2 D）也更高。為了進一步證實EVs通過促進巨噬細胞糖酵解來影響巨噬細胞功能，用糖酵解抑制劑2-DG處理巨噬細胞，以便與HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs共培養。如圖2 H，2-DG 逆轉了 IL1β 和 TGF-β1 表達的上調。

為了證實HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs在體內影響巨噬細胞糖酵解，通過尾靜脈將EVs注射到小鼠體內。結果表明，大多數EVs在注射后24 h 出現在肝臟和腎臟中。此外，注射了經HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs的db/db小鼠顯示出ACR水平升高（圖3 A）以及腎皮質中纖維化和炎癥標志物的表達（圖3 B、C）和腎巨噬細胞中糖酵解的增加（圖3 D、E）。這些結果表明，腎小管上皮細胞衍生的EVs可以在體外和體內影響巨噬細胞糖酵解。

圖2   HSA處理的腎小管上皮細胞衍生的EVs在體外促進巨噬細胞糖酵解。

圖3   HSA處理的腎小管上皮細胞衍生的EVs促進了體內巨噬細胞糖酵解。

HIF-1α促進巨噬細胞糖酵解

根據一些報道，HIF-1α在促進糖酵解中起重要作用。因此，為了研究HIF-1α在調節巨噬細胞代謝重編程中是否是需要的，實驗用HIF-1α siRNA轉染巨噬細胞或用FG-4592（一種脯氨酰羥化酶抑制劑）處理巨噬細胞，分別下調或過表達HIF-1α。結果發現，HIF-1α SIRNA顯著下調巨噬細胞GLUT1、HK2和LDHA（圖4 A） 和 HK2、LDHA 蛋白（圖4 B、C）表達。上清液中的乳酸鹽含量（圖4 D）和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA（圖4 A）在HIF-1α siRNA組中也有所下降。另一方面，FG-4592上調了GLUT1，HK2和LDHA mRNA（圖4 E）和 HK2 和 LDHA 蛋白（圖4 F、G）表達。乳酸含量（圖4 H）和IL1β和TGF-β1的水平在FG-4592組中也較高（圖4 E）。這些數據表明，HIF-1α促進巨噬細胞糖酵解。

圖4   HIF-1α促進巨噬細胞糖酵解。

HSA處理的腎小管上皮細胞衍生的EVs通過穩定HIF-1α促進巨噬細胞糖酵解

為了進一步證實HF-1α在HSA處理的腎小管上皮細胞誘導的巨噬細胞糖酵解中的作用，使用免疫熒光測量腎巨噬細胞中的HIF-1α水平。結果表明，db /db小鼠的腎巨噬細胞HIF-1α水平明顯高于對照小鼠。此外還發現，在與HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs共培養的細胞中，巨噬細胞HIF-1α表達增加，HIF-1α羥基化程度降低，表明HK-2細胞衍生的EVs提高了HIF-1α的穩定性。而且HIF-1α在注射HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs的db / db小鼠的腎巨噬細胞中表達增加。

為了進一步證實HIF-1α參與糖酵解調節，用HIF-1α siRNA轉染巨噬細胞，與HSA刺激的HK-2細胞的EVs共培養。結果發現，HIF-1α的敲低逆轉了GLUT1，HK2和LDHA水平、乳酸產量以及IL1β和TGF-β1表達的增加。這些結果表明，來自HSA刺激的HK-2細胞的EVs通過HIF-1α促進巨噬細胞糖酵解。

最后，實驗探索了HSA處理的HK-2細胞衍生的EVs如何調節HIF-1α的穩定性，并發現EVs中有幾種被報道參與HIF-1α穩定性的miRNAs和lncRNAs增加。

總之，該研究發現，DM小鼠的腎巨噬細胞中糖酵解增強。此外，HSA通過穩定HIF-1α，通過腎小管上皮細胞衍生的EVs促進巨噬細胞糖酵解，從而誘導腎纖維化和炎癥。由于白蛋白尿是DKD治療的障礙，這項研究表明，抑制腎巨噬細胞糖酵解可能是延緩DKD進展的新方法。

參考文獻：Jia Y, Chen J, Zheng Z, Tao Y, Zhang S, Zou M, Yang Y, Xue M, Hu F, Li Y, Zhang Q, Xue Y, Zheng Z. Tubular epithelial cell-derived extracellular vesicles induce macrophage glycolysis by stabilizing HIF-1α in diabetic kidney disease. Mol Med. 2022 Aug 12;28(1):95. doi: 10.1186/s10020-022-00525-1. PMID: 35962319; PMCID: PMC9373297.

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