皮下脂肪組織（SAT）是人體最大的脂質庫。脂肪組織通過招募脂肪生成祖細胞和分化脂肪細胞尺寸的增加而擴張，導致肥大性肥胖。肥大的脂肪細胞導致分泌特征改變，其特征是瘦素和炎性細胞因子水平升高，脂聯素水平降低，從而導致慢性炎癥、氧化應激增加和內質網（ER）應激。脂肪組織通過分泌細胞外囊泡（EVs）來調節代謝、胰島素抵抗（IR）和 2 型糖尿病（T2D）的發展。在 T2Ds 中，脂肪細胞釋放的 EVs 在脂肪細胞和巨噬細胞之間的通訊中發揮重要作用，并可能影響脂肪組織中間充質干細胞的功能。

脂肪來源的間充質干細胞（ASCs）是成體干細胞，具有自我更新和多潛能分化能力。ASCs 可以分化為脂肪細胞，并且是脂肪細胞祖細胞譜系結構的組成部分。ASCs 的衰老和分化抑制在肥胖或代謝性疾病個體中比在正常個體中更為嚴重，但其潛在機制尚不清楚。

越來越多的證據表明，ER 應激激活是涉及不同疾病發病機制的核心特征，包括肥胖相關的 IR 和糖尿病。內質網應激的細胞可以誘導其他細胞的內質網應激。這個概念被定義為可傳遞的 ER 應激（TERS）。EVs 可能是在組織微環境中傳遞 ER 應激的一個促成因素。

河南省人民醫院干細胞研究中心、新鄉醫學院基礎醫學院、鄭州大學第五附屬醫院神經外科研究團隊的一項實驗旨在闡明在肥大性肥胖小鼠模型中，從擴張的脂肪細胞傳遞的 ER 應激促進衰老和抑制 ASCs 分化的機制。結果表明，EVs 是通過部分運輸鐵來實現這些變化，鐵是一種通過積累導致衰老的調節劑。

肥大性肥胖小鼠脂肪細胞和 ASCs 的高 ER 應激水平

肥大型肥胖小鼠模型被喂食高脂飲食 16 周以誘導肥胖。肥大性肥胖小鼠的平均皮下脂肪細胞直徑明顯大于對照小鼠。肥大型肥胖小鼠的體重顯著高于對照小鼠。對皮下脂肪組織樣本的分析表明，肥大型肥胖小鼠的 ER 應激標志物（Xbp1、sXbp1、Atf6、Atf4和Grp78）的 mRNA 表達水平顯著高于對照小鼠。

為了進一步研究每種細胞類型對 ER 應激的作用，實驗檢測了脂肪細胞和 ASCs 的 ER 應激標志物的 mRNA 表達和蛋白質水平。分離的 ASCs 在相應的分化誘導培養基中可以分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞。ASCs 的表面標志物 CD73、CD90 呈陽性，CD34 和 CD45 呈陰性。脂肪細胞中 ER 應激相關基因和 GRP78 蛋白的表達水平顯著高于肥大性肥胖小鼠皮下脂肪細胞衍生的 ASCs。

肥大型肥胖小鼠 ASCs 衰老表型增加

之前報道過，慢性 ER 應激會隨著年齡的增長而增加。在 T2D 高風險的肥大性肥胖個體中檢測到脂肪形成前體細胞的衰老表型。因此，實驗測量了肥大性肥胖小鼠中 ASCs 的衰老表型。肥大型肥胖小鼠的 ASCs 中 SA-β-gal 染色的陽性率顯著高于對照組小鼠（圖1 a）。油紅O染色結果（圖1 b）和脂肪細胞特異性基因（Pparg、Plin1和Insr）表達檢測（圖1 f）表明， ASCs 的成脂分化潛能在肥大型肥胖小鼠中降低。在肥大型肥胖小鼠的 ASCs 中，細胞群倍增時間（圖1 c）增加，相對端粒酶長度 T/S 比（圖1 d）降低。肥大性肥胖小鼠的 ASCs 中的衰老標志物（P16和P53）和衰老相關分泌表型（SASP）標志物（IL6和Ccl2）也增加（圖1 e、h）。

圖1   肥大性肥胖小鼠ASCs中的衰老表型增加。

脂肪細胞在體外誘導 ASCs 的 ER 應激和衰老

考慮到肥大型肥胖小鼠的脂肪細胞中的 ER 應激水平高于ASCs 中的水平，研究人員懷疑脂肪細胞將 ER 應激傳遞給 ASCs。實驗分別將來自肥大性肥胖和正常對照小鼠的皮下脂肪細胞與正常 ASCs 共培養。共培養 48 小時后收集 ASCs，結果顯示在與來自肥大性肥胖小鼠的脂肪細胞共培養的 ASCs 中，衰老（P16和P21）和 SASP（IL6和Ccl2）標志物和 ER 應激相關基因（sXbp1和Grp78）的 mRNA 表達和蛋白水平（圖1 g、j）顯著高于與來自對照小鼠的脂肪細胞共培養的 ASCs。與肥大型肥胖小鼠脂肪細胞共培養的 ASCs SA-β-gal 染色陽性率顯著高于與對照小鼠脂肪細胞共培養的 ASCs（圖1 i）。

來自肥胖脂肪細胞的 EVs 促進 ASCs 中的 TERS 和衰老

細胞可以通過 EVs 將 ER 應激傳遞給微環境中的其他細胞。分離肥大性肥胖和對照小鼠脂肪細胞上清培養物中的 EVs，并與對照組 ASCs 共培養，以探索 EVs 對 ASCs 的 ER 應激和衰老的影響。

通過蛋白質印跡鑒定 EVs 的蛋白質標記物（CD63 和 CD81）。從肥胖組的脂肪細胞中分離出的 EVs 的蛋白質含量高于從對照組的脂肪細胞中分離出的 EVs。通過熒光顯微鏡觀察，脂肪細胞分泌的EVs可以進入ASCs并定位在ER附近的區域。ER 應激標記物（ Xbp1、sXbp1、Atf4、Atf6和Grp78 ）的 mRNA 表達水平在用肥大性肥胖脂肪細胞衍生 EVs 處理的 ASCs 中顯著高于用對照脂肪細胞衍生 EVs 處理的 ASCs。油紅 O 染色顯示，用肥大性肥胖脂肪細胞的 EVs 預處理的 ASCs 的脂肪生成潛力低于用對照肥胖脂肪細胞的 EVs 預處理的 ASCs。

為了研究脂肪細胞 EVs 對 ASCs 的影響，肥胖小鼠的脂肪細胞用 20? μM GW4869（可以抑制 EV 分泌）或 DMSO 處理 12 小時。然后，將脂肪細胞轉換為正常的無血清培養基 12 小時。將來自 GW4869 預處理的脂肪細胞或對照脂肪細胞的 EVs 添加到 ASCs 培養基中 12 小時。ER 應激的 mRNA 和蛋白質水平（Xbp1、sXbp1、Atf4和Grp78）、衰老（P16和P21）和 SASP（IL6和Ccl2）標記和SA-β-gal染色陽性率在與源自 GW4869 預處理的肥胖脂肪細胞的 EVs 共培養的 ASCs 中低于與源自肥胖脂肪細胞的 EVs 共培養的 ASCs。

攜帶鐵的EVs 促進 ASCs 中的鐵儲存和衰老

鐵的積累與細胞衰老密切相關。肥胖個體脂肪組織中的鐵含量明顯高于正常體重個體脂肪組織中的鐵含量。因此，實驗分別檢測了脂肪細胞和 ASCs 中鐵代謝相關基因的表達水平。肥大型肥胖小鼠的脂肪細胞和 ASCs 中的鐵代謝基因（Ftl、Fth、Fpn1和Tfrc）和蛋白質（FTH）水平高于正常對照小鼠（圖2 a、b、g）。

EVs 的運輸是鐵代謝的重要途徑。來自肥胖小鼠的脂肪細胞衍生的 EVs 與來自對照小鼠的 EVs 的共培養也可以改善 ASCs 中鐵代謝相關基因和蛋白質的表達（圖2 c、h）。來自肥大型肥胖小鼠的脂肪細胞在含有 50 μM 去鐵胺（DFO）或 DMSO 的培養基中培養?12小時，以驗證這些細胞是否可以通過 EVs 傳遞離子并導致 ASC 衰老。然后，將脂肪細胞轉換為正常的無血清培養基 12 小時。將來自 DFO 預處理的脂肪細胞或對照脂肪細胞的 EVs 置于 ASCs 培養基上 12 小時。收集 ASCs，并測量衰老和 ER 應激相關基因的表達水平。結果表明，ER應激、鐵代謝和衰老相關基因（圖2 d）和蛋白質（圖2 i）的表達水平在 DFO 處理組中顯著低于對照組。油紅 O 染色和 SA-β-gal 染色表明，與源自用 DFO 預處理的肥胖脂肪細胞的 EVs 共培養的 ASCs 中的脂肪形成潛力和衰老低于與源自肥胖脂肪細胞的 EVs 共培養的 ASCs（圖2 e、f）。

圖2   脂肪細胞衍生的EVs中鐵對ASCs衰老和ER應激的影響。

圖3    可傳播的內質網應激促進 ASC 衰老的模式。肥大性肥胖脂肪細胞中的高水平 ER 應激可以通過 EVs 攜帶的鐵轉移到 ASCs。衰老表型隨著 ASCs 中 ER 應激水平的增加而加劇。

總之，該研究表明肥大的脂肪細胞通過可轉運的內質網應激導致 ASCs 的衰老和分化遲緩（圖3）。針對性地降低肥大脂肪細胞的EV分泌或鐵的輸出可能有助于肥大性肥胖和IR的治療。

參考文獻：Fang J, Li L, Cao X, Yue H, Fu W, Chen Y, Xu Z, Zhao Q, Zhao J, Wang Y, Liang W. Transmissible Endoplasmic Reticulum Stress Mediated by Extracellular Vesicles from Adipocyte Promoting the Senescence of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Hypertrophic Obesity. Oxid Med Cell Longev. 2022 Aug 5;2022:7175027. doi: 10.1155/2022/7175027. PMID: 36035215; PMCID: PMC9410860.

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