誘導多能干細胞（iPSCs），可通過重編程體細胞（包括口腔組織細胞）產生，具有無限的自我更新特性，可以分化成任何類型的細胞和組織。因此，iPSCs被認為是一種很有前途的工具，不僅用于組織再生，而且通過體外制造三維（3D）組織/器官（類器官）進行疾病建模。

機械應力是iPSCs類器官形成的一種有前途的操作技術。機械力調節干細胞中的許多生物反應。機械刺激誘導iPSCs向骨和軟骨細胞譜系分化和成熟。因此，機械力對干細胞反應的影響在很大程度上取決于與力和細胞相關的許多因素，包括力的類型、大小、持續時間、細胞類型和細胞階段。

在口腔科學領域，間歇性壓縮力（ICF）在與咀嚼、咬合或正畸治療相關的細胞行為調節方面得到了特別好的研究。ICF調節許多信號通路并進一步影響各種細胞反應。因此，需要進行系統分析來研究ICF如何影響細胞反應。

已經在各種條件下研究了全局基因表達譜，以確定機械力調節的潛在途徑。ICF處理的PDLCs在局灶粘附，肌動蛋白細胞骨架調節，TGF-β信號通路和細胞因子-細胞因子受體通路中顯示出基因表達的顯著變化。在這種情況下，開發有效的再生醫學和工程細胞操作方法需要了解響應機械刺激的全局基因表達譜，特別是在能夠在體外形成復雜類器官的iPSCs中。然而，ICF對iPSCs的影響仍然未知。

日本東北大學牙科研究生院、朱拉隆功大學牙科學院研究團隊的一項研究旨在通過使用RNA測序進行全局基因表達分析，鑒定3D培養小鼠iPSCs中ICF調控的途徑。

ICF處理的iPSCs的差異基因表達譜

將小鼠iPSCs形成的擬胚體進行總RNA分離以進行高通量RNA測序。ICF（1.5?g·cm^-2，0.23?Hz）處理24小時后，與未負荷對照相比，iPSC結構沒有顯著形態變化。與未負荷對照相比，ICF在24小時不影響細胞活力。ICF處理上調了893個基因，下調了1076個基因。差異調控基因在生物過程、細胞成分和分子功能上分別與代謝過程、膜和蛋白質結合有關。

基于蛋白質-蛋白質相互作用網絡BIOGRID功能數據庫進行基于網絡拓撲的分析，豐富生物過程類別中的基因本體。上調基因的富集基因本體類別與細胞周期有關，而下調基因的富集基因本體類別與小分子和輔助因子代謝過程相關。

ICF 影響 iPSCs 中的 p53 和細胞周期通路

使用KEGG數據庫進行的生物信息學分析揭示了ICF調控的幾種通路。上調基因參與p53信號通路和FoxO信號通路，而下調基因參與HIF-1信號通路。與對照組相比，p53信號通路中的20個基因（圖1 a）和細胞周期通路中的11個基因（圖1 b）在ICF處理中差異表達。圖1 a所示的20個差異表達基因均分布在p53信號通路KEGG數據庫的通路圖（map04115）中，表明ICF影響了p53通路的大多數組，包括細胞周期（G1停滯）、細胞凋亡、DNA修復/損傷預防和p53負反饋。Ccnd1與Cdk6形成復合物以調節G1 / S轉變，存在于p53信號通路和細胞周期的熱圖中（圖1 a、b）。細胞周期蛋白G1（Ccng1）在DNA損傷后上調，并作為負反饋系統減弱p53的活性。基于這些結果，實驗專注于Ccnd1、Cdk6和Ccng1，以使用實時定量聚合酶鏈反應（PCR）驗證這些基因的mRNA表達（圖1 c-e）。ICF 誘導 iPSCs 中的Ccnd1、Ccng1 和Cdk6 mRNA 表達（圖1 c-e）。

圖1   ICF調節iPSCs中的P53和細胞周期通路

使用KEGG數據庫對用ICF和對照處理的iPSCs進行RNA測序分析。熱圖顯示了P53信號通路和細胞周期通路（a、b）中差異表達的基因。 （c-e） 圖表示 RNA 測序結果中選定基因（Ccnd1、Ccng1 和Cdk6）的 mRNA 表達。

為了進一步確認生物學功能，在無血清培養基中ICF處理24 小時后，使用流式細胞術進行細胞周期分析（條件1）。ICF處理導致SubG0群體減少，S期群體增加（圖2 b、c）。ICF后，將細胞在正常生長培養基（血清存在下）中維持48小時并用于細胞周期分析（圖2 a）（條件2）。與對照組相比，ICF刺激后G0/G1群體顯著減少，而S和G2/M群體顯著增加（圖2 e、f）。在兩種條件下，增殖指數均顯著增加（圖2 d、g）。

圖2   ICF促進細胞周期進程

實驗方案如（a）所示。條件的細胞周期分析：（1）iPSCs在無血清培養基（b，c）中用ICF處理24小時，（2）24小時后，將細胞在正常生長培養基中維持48小時（e、f）。條件 1 和 2 中的增殖指數如（d、g） 所示。

ICF處理的SubG0細胞數量的減少意味著細胞凋亡的減少。為了確認細胞凋亡的減少，用膜聯蛋白V和碘化丙啶（PI）對細胞進行熒光染色，以鑒定早期和晚期細胞凋亡中的細胞。流式細胞術顯示，ICF顯著減弱了早期凋亡細胞的數量，但不影響晚期凋亡細胞的數量（圖3 a、b）。

圖3   ICF減少早期凋亡細胞的數量

iPSCs在無血清培養基中用ICF處理24小時。細胞用膜聯蛋白V和碘化丙啶（PI）染色。早期和晚期凋亡細胞的百分比如（a、b）所示。

ICF通過TGF-β信號通路調節細胞周期相關基因的表達

TGF-β信號通路在干細胞中受到機械應力的刺激。由于Tgfb1被鑒定為通過ICF刺激差異表達的細胞周期基因（圖1 b），實驗專注于TGF-β信號通路作為ICF調節細胞周期相關基因表達的可能機制。實時熒光定量PCR分析顯示，ICF刺激在24 h后顯著上調Tgfb1 mRNA表達（圖4 a）。酶聯免疫吸附測定（ELISA）和免疫熒光染色也證實了24小時時顯著的Tgfb1蛋白表達（圖4 b、c）。

為了研究TGF-β信號通路在ICF調節細胞周期中的參與，用4 μmol·L?1SB431542，TGF-β受體的抑制劑，在ICF應用前預處理iPSCs 30分鐘（實驗方案如圖4 d所示）。SB431542減弱了ICF對Ccnd1和Cdk6 mRNA表達的影響（圖4 e、f）。相比之下，SB431542預處理后Ccng1 mRNA表達水平無顯著變化（圖4 g）。與mRNA結果相對應，SB431542預處理降低了力誘導的Ccnd1蛋白表達（圖4 h）。

圖4   ICF通過TGF-β信號通路調節細胞周期相關基因表達

iPSCs在無血清培養基中用ICF處理。在2、8和24 h（a）使用實時熒光定量PCR研究了Tgfb1 mRNA表達，并在24 h通過ELISA（b）和免疫熒光染色（c）測定Tgfb1蛋白表達。在TGF-β抑制實驗中，在暴露于壓縮力之前用SB431542（4 μmol·L?1）處理細胞30分鐘。實驗方案如（d）所示。Ccnd1、Ccng1 和Cdk6的 mRNA 如 e-g 所示。使用蛋白質印跡分析（h）檢查Ccnd1的蛋白表達。

總之，該研究表明，ICF促進iPSC增殖和細胞周期，抑制細胞凋亡。TGF-β信號通路可能參與 iPSCs 中 ICF 誘導的細胞周期進程。

參考文獻：Manokawinchoke J, Limraksasin P, Okawa H, Pavasant P, Egusa H, Osathanon T. Intermittent compressive force induces cell cycling and reduces apoptosis in embryoid bodies of mouse induced pluripotent stem cells. Int J Oral Sci. 2022 Jan 4;14(1):1. doi: 10.1038/s41368-021-00151-3. PMID: 34980892; PMCID: PMC8724316.

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