在牙齒移動過程中，牙周組織中形成無菌炎癥微環境，其特征在于炎癥細胞因子，趨化因子的表達升高和炎癥免疫細胞的激活增加。作為牙周組織中的主要間充質干細胞（MSCs），牙周膜干細胞（PDLSCs）在牙齒移動過程中不斷接受機械力刺激，參與炎癥反應和骨重建過程。

自噬已逐漸被認為是在外部刺激（例如應激，炎癥，缺氧和機械負荷）下維持細胞和組織穩態的重要保護性細胞過程。此外，自噬也可能適應機械負荷，可以在成骨細胞、內皮細胞和 PDLSC s等機械敏感細胞中被激活。然而，PDLSCs中的自噬是否影響機械力刺激下牙周組織的炎癥微環境需要進一步探索。

在機械力誘導的炎癥骨重建過程中，巨噬細胞被認為是重要的免疫細胞之一。在體內復雜的微環境中，其表現出du'te的表型和功能：經典型巨噬細胞極化主要由M1型巨噬細胞構成，表現出與炎癥和細胞毒性相關的功能，另一型巨噬細胞極化主要由M2型巨噬細胞構成，與組織修復和免疫調節相關。研究已經證實，M1巨噬細胞極化在牙齒移動期間的骨重建和牙根吸收過程中至關重要。

鑒于M1巨噬細胞極化在牙齒移動過程中的重要性，北京大學口腔醫學院、山西醫科大學口腔醫院牙體牙髓科聯合團隊的一項研究曾假設PDLSCs中的自噬在機械力刺激下影響巨噬細胞極化，從而影響牙槽骨重建，研究旨在驗證PDLSCs中力誘導的自噬是否以及如何調節巨噬細胞極化，并有助于牙周炎微環境和牙齒移動過程中的骨重建。

PDLSCs中力誘導的自噬有助于體內M1巨噬細胞極化

為了研究機械力是否可以激活自噬，建立了牙齒移動的實驗動物模型，并使用抑制劑3-MA阻斷自噬。機械力刺激7天后，牙齒移動距離增加，而注射3-MA可縮短此距離（圖1 A）。機械力刺激后，自噬蛋白LC3、促炎細胞因子TNF-α和MSC表面標志物CD146在牙周組織受壓側的表達增加。同時，TRAP+ 破骨細胞數量也增加（圖1 B、C）。3-MA可顯著降低LC3、TNF-α和CD146的表達，以及TRAP+ 破骨細胞的數量。盡管如此，與對照組相比，機械力+3-MA組CD146 + MSCs 和TRAP+ 破骨細胞數量仍上調（圖1 B、C）。

為了評估力誘導自噬對體內巨噬細胞極化的影響，進行了免疫熒光染色以鑒定力刺激后巨噬細胞標志物的變化。受力刺激后牙周韌帶受壓側 CD68 + iNOS + M1巨噬細胞數量增加，3-MA注射后顯著減少。雖然機械力+3-MA處理后CD68 + CD163 + M2巨噬細胞數量增加，但受力刺激后M1/M2巨噬細胞極化比顯著增加，3-MA注射后顯著降低（圖1 D）。這些數據表明，自噬調節機械力刺激后的巨噬細胞的極化，并影響牙槽骨重建和牙齒移動過程。

圖1   機械力誘導的自噬有助于體內牙齒運動過程中的M1巨噬細胞極化和骨重塑。

機械力激活PDLSCs中的自噬

為了探索機械力下的自噬活性，在體外對PDLSCs進行了蛋白質印跡，免疫熒光染色自噬通量測定和TEM。LC3是最重要的自噬相關蛋白之一。在12 小時的0.5-2.5 g/cm2的壓縮力負荷下，LC3II/I的表達增加。然而，1.0和1.5g/cm2的壓縮力觸發了LC3II/I 的zui強表達，隨后在實驗中使用 1.5g/cm2 壓縮力。

壓縮力刺激3 h后LC3II/I的表達量開始增加，并持續至24 h。此外，在壓縮力刺激2、6h后，另一種自噬標志物P62/SQSTM（P62）的表達下降，而Beclin1的表達在力刺激3h后增加。實時熒光定量PCR顯示，與對照組相比，Beclin1的mRNA表達明顯上調。免疫熒光染色顯示，在壓縮力刺激12h后，PDLSCs中聚集的LC3陽性表達，在雷帕霉素應用后進一步增強。

用壓縮力刺激細胞12 h，用顯微鏡檢測自噬通量。結果表明，自噬溶酶體和自噬體的數量顯著較高。此外，壓縮力刺激后，TEM可在PDLSCs中發現明顯的自噬體。這些數據表明，在壓縮力刺激下，PDLSCs的自噬可以在壓縮力依賴性和時間依賴性趨勢中被激活。

力刺激的PDLSC自噬在體外誘導M1巨噬細胞極化

為了進一步檢測力刺激的PDLSCs中的自噬是否會影響巨噬細胞極化，使用來自機械力刺激的PDLSCs（FS）、機械力刺激的PDLSCs + 3-MA處理（FS + 3-MA）或自噬激活劑雷帕霉素（FS + Rapa）的上清液來處理THP-1來源的巨噬細胞，無力加載作為對照（CS）（圖2 A）。

FS組THP-1來源巨噬細胞中M1巨噬細胞相關標志物TNF-α和iNOS的mRNA表達水平上調，在FS + 3-MA組下調，而FS + Rapa組進一步上調。然而，未觀察到M2巨噬細胞相關標志物精氨酸酶-1和DECTIN-1的表達（圖2 B）。

免疫細胞化學分析顯示，FS組CD68 + iNOS + M1巨噬細胞比例顯著增加，在FS + 3-MA組部分被阻斷，而FS + Rapa組增強。然而，CD68 + CD163 + M2巨噬細胞的比例沒有改變（圖2 C、D）。蛋白質印跡分析顯示，FS組M1巨噬細胞相關標志物iNOS的表達顯著增加，在FS + 3-MA組下調，而FS + Rapa組上調（圖2 E）。然而，M2巨噬細胞相關標志物精氨酸酶-1的表達沒有改變（圖2 E）。僅應用3-MA或雷帕霉素不會改變THP-1巨噬細胞中TNF-α或精氨酸酶-1的表達。這些數據表明，在機械力刺激的PDLSCs中，自噬可以在體外引導巨噬細胞向M1表型極化。

圖2   力刺激的PDLSC自噬在體外誘導M1巨噬細胞極化。

牙周膜干細胞自噬通過抑制AKT信號通路調節M1巨噬細胞極化

在驗證了PDLSC自噬與巨噬細胞極化之間的關系后，實驗最后探討了其潛在機制。AKT信號通路已被gong'ren為巨噬細胞存活和極化的關鍵介質。作為巨噬細胞中的關鍵轉錄因子，NF-κB 活性的增加引導巨噬細胞向M1表型極化。

實驗發現，當將條件培養基應用于THP-1來源的巨噬細胞中時，FS組中磷酸化-AKT的表達受到顯著抑制，而3-MA（FS + 3-MA）阻斷自噬會增加磷酸化-AKT的表達，雷帕霉素增強自噬逆轉了上述磷酸化-AKT水平的增加。相比之下，在機械力刺激的PDLSCs的上清液中孵育后，NF-κB / P65的表達上調，雷帕霉素進一步增強。

為了進一步確認調控機制，將AKT信號激活劑IGF1和抑制劑GSK690693應用于THP-1衍生的巨噬細胞。 FS + Rapa+ DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達量增加，IGF1應用后降低（圖3 A）。未觀察到M2標記精氨酸酶-1的表達發生變化。在FS + Rapa+ DMSO組中，M1巨噬細胞相關標志物iNOS和TNF-α的mRNA水平一致升高，IGF1應用后下降，而M2巨噬細胞相關標志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 的mRNA表達無變化（圖3 C）。

此外，FS + 3-MA + DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達下降。應用GSK690693后，TNF-α和NF-κB/P65的表達在蛋白質水平上顯著增加（圖3 B）。在FS + 3-MA + DMSO組中，iNOS和TNF-α的mRNA表達水平一致下降，應用GSK690693后升高，而M2巨噬細胞相關標志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 表達無變化（圖3 D）。這些數據表明，機械力刺激的PDLSCs中的自噬激活通過抑制AKT信號通路誘導M1巨噬細胞極化。

圖3   PDLSC中力誘導的自噬通過AKT信號通路調節M1巨噬細胞極化。

圖4   圖形概要。

總之，PDLSCs中機械力刺激的自噬通過抑制AKT信號通路引導巨噬細胞進入M1表型，從而有助于骨重建和牙齒移動（圖4）。這些結果有助于更好地了解PDLSCs如何響應機械刺激并與巨噬細胞極化的相互作用，從而調節牙槽骨骨重建。研究結果還表明，調節MSC自噬可能調節炎癥性骨重建和再生過程。

參考文獻：Jiang N, He D, Ma Y, Su J, Wu X, Cui S, Li Z, Zhou Y, Yu H, Liu Y. Force-Induced Autophagy in Periodontal Ligament Stem Cells Modulates M1 Macrophage Polarization via AKT Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021 May 26;9:666631. doi: 10.3389/fcell.2021.666631. PMID: 34124048; PMCID: PMC8187804.