肺動脈外膜成纖維細胞（PAAFs）對血管細胞外基質（ECM）穩態和重塑很重要，有證據表明PAAFs受基質剛度、拉伸應力或過度拉伸損傷和缺氧的調節。在損傷期間，PAAFs被激活并分化為肌成纖維細胞亞型，通過直接改變ECM蛋白（包括膠原蛋白，纖連蛋白和彈性蛋白）的表達、降解或交聯來重塑血管壁特性。鑒于ECM也可作為細胞粘附的基質，并發送決定細胞表型的物理和化學線索，因此有人認為基質變硬可能預示著組織重塑，并且是肺動脈高壓的致病驅動因素。

肺動脈高壓（PAH）是一種血管病變，表現為肺動脈壓持續升高、血管收縮和不可逆的血管重塑。肺動脈壁外膜中的PAAFs對變化的機械條件和功能作出反應，重塑ECM，從而調節其機械特性。雖然成纖維細胞活化誘導血管膠原基質的組成和結構發生變化，但尚不清楚PAAFs如何受到基質組成和剛度的調節，如何受到PAH期間負荷增加引起的血管拉伸改變的影響，以及哪些信號通路調節這些對物理刺激的表型反應。

為了更好地識別PAH期間調控PAAFs反應的受體和通路，美國加州大學圣地亞哥分校生物工程系的研究團隊曾構建了PAAFs的機械信號模型，并對不同剛度凝膠和不同拉伸條件下培養的PAAFs進行了體外實驗，以確定六個促纖維化基因對模擬PAH輕度和重度階段的拉伸和剛度變化的反應。該分析表明，細胞拉伸和ECM剛度變化差異激活的通路可能有助于闡明PAAFs中組織重塑的順序。相關內容發表在 CELLS期刊題為“Substrate Stiffness and Stretch Regulate Profibrotic Mechanosignaling in Pulmonary Arterial Adventitial Fibroblasts"。

PAAFs 上調促纖維化基因以響應基質剛度和拉伸增加

實驗使用對應于正常血壓的肺動脈（0.5 kPa）、輕度PAH（3 kPa）和重度PAH（10 kPa）的硬度制備聚丙烯酰胺水凝膠，模擬體內不同階段的物理基質剛度。PAAFs在0.5 kPa剛度6孔板上培養三天后從肌成纖維細胞恢復為成纖維細胞表型，與在較硬的基質上生長的細胞相比，Acta2的表達降低，培養時呈圓形（圖1 B），而在較硬的基質上生長的細胞則呈星狀，Acta2表達較高（圖1 C、D）。在0.5 kPa底物上培養的成纖維細胞中Col1a1，Col3a1，Eln，Fn1，Loxl1和Acta2基因的信使RNA水平與從正常血壓大鼠的肺動脈外膜中提取的RNA水平沒有顯著差異（圖1 A）。這表明，在0.5 kPa基質上培養的細胞可以模擬以下研究中六個基因在體內PAAFs中的表達。

與在0.5 kPa底物上培養的PAAFs中的mRNA水平相比，六個基因均響應基質剛度的增加而顯著上調。Acta2和Loxl1的表達在3 kPa基質生長的細胞上明顯更高，但在10 kPa基質生長的細胞上不顯著，與0.5 kPa基質相比（圖1 A），Col1a1、Col3a1、Eln和Fn1在10 kPa基質上顯著上調（與晚期PAH中的動脈硬度相當）。有趣的是，Acta2和Loxl1的表達表現出非單調效應，與0.5 kPa基質相比，3 kPa基質上的基因表達顯著上調，但在0.5 kPa和10 kPa基質上培養的細胞之間沒有顯著差異。

圖1     基質剛度對肺動脈內皮成纖維細胞（PAAF）分化的影響。

檢查六個基因在10% 等雙軸拉伸24小時的PAAFs中的轉錄反應（圖2 A-F），與未拉伸細胞相比，Col1a1、Col3a1、Eln、Loxl1 和 Acta2 顯著上調，而不依賴于基質剛度。 雖然Fn1表達在拉伸24小時后沒有顯著變化（圖1 A），但在所有凝膠剛度下，Fn1表達在4小時后都顯著上調。另一方面，Col1a1僅在拉伸24小時后顯著上調，但在4小時后沒有。這表明Fn1是由短時間的拉伸短暫誘導的，而Col1a1對拉伸的反應要慢得多。這一發現與將Fn1確定為早期反應基因的報道一致。在六個基因的表達中沒有發現基質剛度和拉伸之間的顯著交互作用。

根據事后測試，在3 kpa和10 kpa時，ECM剛度的增加顯著上調了III型膠原蛋白和平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達。這與膠原蛋白III（Col3a1）和SMA（Acta2）的RNA相對表達一致，如圖1 B、F，從0.5 kPa-3 kPa 顯著增加，而從3 kPa-10 kPa沒有進一步顯著增加。

圖2    剛硬和拉伸對肺動脈內皮成纖維細胞（PAAFs）基因表達的影響。

PAAF網絡模型模擬剛度和拉伸激活的基因表達

該模型預測，基質剛度從0.5 kPa增加到3或10 kPa 時，所有六個基因都會顯著上調（圖3）。這些模型的預測與實驗觀察結果相符，即所有六個基因在較硬基質上生長的細胞中都顯著上調。

該模型還預測了在 10% 等雙軸拉伸誘導24小時后，Col1a1，Col3a1，Loxl1和Acta2的基因表達上調，Fn1表達恢復到基線水平。然而，該模型預測Eln表達隨拉伸而下調，而實驗結果顯示上調。雖然該模型與數據在定性上一致，但它并沒有概括Loxl1和Acta2的非單調效應（圖1 A）。

圖3    由于拉伸和剛度引起的基因活性的實驗觀察（Expt）與模型預測（模型）的比較。

血管緊張素 II 受體抑制揭示了剛度和拉伸對纖連蛋白基因表達的相互作用

基于敏感性分析，實驗模擬了模型中三個力學敏感節點（AT1、TGF-β、MST1/2）抑制劑存在時拉伸和剛度增加的影響。圖4 顯示了抑制AT1、TGF-β 和 MST1/2 對基質剛度從 0.5-3 kPa 增加以及拉伸引起的基因表達變化的影響。

圖4   由抑制血管緊張素II受體I型（AT1）、轉化生長因子-β（TGF-β）和巨噬細胞刺激1或2（MST1/2）受體對剛度和拉伸的反應而引起的基因表達變化。

從模型模擬中可以看出，基質剛度增加對Loxl1表達的誘導是由MST1/2信號通路特異性調控的，而其他5個基因對剛度的反應均被阻斷TGF-β受體顯著抑制。AT1 受體抑制顯著減弱了Col1a1、Col3a1、Fn1和Acta2的剛度依賴性誘導，但對Eln或Loxl1無顯著影響，且抑制幅度明顯小于阻斷TGF-β受體時。在增加基質剛度的模型中阻斷血管緊張素信號使膠原蛋白下調20%，阻斷TGF-β信號使膠原蛋白下調30%，而阻斷血管緊張素使Acta2下調17%，阻斷TGF-β使其下調86%（圖4）。

在施加拉伸刺激的同時阻斷模型中的TGF-β信號抑制了Acta2的上調，并下調Eln。拉伸誘導的Col1a1和Col3a1通過抑制MST1/2和血管緊張素II信號而降低，而拉伸對Loxl1的調節僅通過抑制MST1/2受到影響。Fn1表達未因拉伸而顯著改變，在所有三種抑制劑存在下均保持不變。這與它對基質剛度的響應形成鮮明對比，其中抑制AT1 和TGF-β受體具有顯著作用（圖4）。

由于該模型表明血管緊張素II信號在調節Fn1表達以響應剛度增加而不是拉伸時發揮重要作用（圖4、圖5 B），因此用1 M氯沙坦（一種AT1受體阻滯劑）處理培養的PAAFs。

與0.5 kPa相比，氯沙坦消除了3 kPa基質對纖連蛋白mRNA表達的誘導，并且在0.5 kPa基質上生長的PAAFs中的Fn1表達在24 h后仍然對拉伸無反應（圖5 A）。當血管緊張素II信號被阻斷時，拉伸顯著上調了生長在較硬的3 kPa基質上的PAAFs Fn1的表達。

圖5 A中各實驗條件下Fn1表達對剛度、拉伸和AT1受體抑制增加的響應模型模擬如圖5 B所示。該模型概括了對照條件和當基質剛度從0.5 kPa增加到3 kPa時纖連蛋白mRNA的增加，以及Fn1在3 kPa基質上對拉伸誘導的定性響應。該模型還正確預測了在拉伸和未拉伸條件下，氯沙坦對拉伸24小時后0.5 kPa基質上的Fn1 mRNA水平沒有影響。然而，雖然在體外觀察到氯沙坦通過增加未拉伸的PAAFs的剛度來抑制Fn1上調，但該模型無法重現這一觀察結果。

圖5   使用和不使用AT1受體抑制劑氯沙坦時，纖維連接蛋白基因表達對基質剛度增加和10%等雙軸拉伸的反應的實驗觀察。

總之，使用各種剛度的水凝膠底物在細胞拉伸裝置中的體外實驗表明，PAAFs對促纖維化基因的表達受細胞拉伸和細胞外基質剛度的差異調控。對于這里研究的六個基因，沒有觀察到拉伸和剛度之間的相互作用效應，然而，AT1受體阻斷發現，當在堅硬而不是柔軟的基質上生長時，通過拉伸，PAAFs中血管緊張素不依賴于Fn1表達的激活。響應改變的機械條件的PAAF促纖維化細胞信號的體外和計算機模型的新組合可能有助于識別血管外膜重塑的調節因子，這種調節因子是由體內PAH進展期間發生的拉伸和基質剛度的變化引起的。

參考文獻：Wang A, Cao S, Stowe JC, Valdez-Jasso D. Substrate Stiffness and Stretch Regulate Profibrotic Mechanosignaling in Pulmonary Arterial Adventitial Fibroblasts. Cells. 2021 Apr 23;10(5):1000. doi: 10.3390/cells10051000. PMID: 33922850; PMCID: PMC8146344.

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