Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1

KWS：Piezo1；M2 macrophage；mechanotransduction；bone formation；TGF-β1

骨骼是一種動態組織，通過兩個密切聯系的過程維持生長和重塑：骨吸收（bone resorption）和骨形成（bone formation）。免疫細胞在骨重塑過程中處于壓力和負荷之下，它們在免疫中的作用尚未得到充分分析。巨噬細胞是多用途的免疫系統細胞，對代謝控制、病原體防御和組織修復至關重要。M1巨噬細胞產生腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL-6）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS），M2巨噬細胞產生精氨酸酶-1（Arg-1）、白細胞介素-10（IL-10）、重組甘露糖受體C型（MRC1）、CD206和TGF-β，對骨重塑過程至關重要。

Piezo1，一種非選擇性 Ca2+ 滲透性陽離子通道，已被證明可以將機械信號傳遞到巨噬細胞，從而可以檢測機械應力。研究表明，Piezo1在骨組織中被下調，從而減緩骨折愈合，而其特異性激動劑激活Piezo1可加速骨折愈合和軟骨轉化為骨骼。此外，張力可以影響巨噬細胞功能和向M2的極化，并證明了10% 的應變強度是激活M2型巨噬細胞的zuijiaxuanzhe。最近的研究表明，巨噬細胞通過促進血管生成和成骨，至少部分通過分泌轉化生長因子（TGF）在骨形成中起著至關重要的作用。體內研究也表明，TGF-β1 對骨修復至關重要。然而，巨噬細胞介導骨骼發育的機制仍然知之甚少。

盡管大量研究表明巨噬細胞對間充質干細胞（MSCs）的成骨作用，但在機械張力下，哪種巨噬細胞表型對MSC有利尚無定論。在南京醫科大學附屬口腔醫院口腔正畸科、蘇州大學附屬獨墅湖醫院口腔科及江蘇省口腔疾病研究重點實驗室聯合團隊的一項研究中，創建了一個張力細胞模型來研究機械應變如何影響巨噬細胞的表型轉化，發現最佳機械應變幅度表現出強大的免疫調節作用并促進 M2 巨噬細胞極化。該研究證明了 Piezo1 介導的鈣內流變化以及 p53 乙酰化和去乙酰化，導致巨噬細胞向 M2 極化，分泌 TGF-β1 并促進 BMSC 成骨。研究成果發表在 Cell Proliferation 期刊題為“Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1"。

首先，鑒于M2巨噬細胞可以誘導MSCs成骨分化，因此，研究人員假設機械張力會刺激 M2 型巨噬細胞轉化，導致 BMSCs 啟動成骨。實驗將RAW264.7細胞暴露于10%，0.5 Hz的循環正弦連續拉伸應變0-6小時以檢查巨噬細胞的變化（圖1 A），發現隨著時間的延長，巨噬細胞上出現了更多的偽足，表明存在更多的M2型巨噬細胞，且M2巨噬細胞釋放主要細胞因子的表達水平也升高。

為了研究巨噬細胞對張力的極化響應，對M1-和M2-極化巨噬細胞進行蛋白質印跡分析，發現應變增加了 RAW264.7 細胞中 CD206+ 細胞的比例，進一步表明應變改變了巨噬細胞的表型。此外，對 F4/80 和 CD206（M2 標志物）進行了雙重免疫染色，發現M2巨噬細胞的增加在第2h更為明顯，RAW264.7細胞強烈表達F4/80。這些結果表明，張力以時間依賴性方式導致巨噬細胞極化為M2型，并且在2h時影響變得更加明顯。因此，2h便作為進一步研究的時間點。

為了檢測巨噬細胞衍生培養基是否對BMSCs的遷移有影響，將BMSCs和巨噬細胞間接共培養（圖1 A）。結果顯示，2h張力刺激時遷移潛力最大（圖1 B）。此外，與 RAW264.7 細胞間接共培養的 BMSCs 增殖也受到影響，不同張力處理組（0、1h、2h、4h 、6h）的 BMSCs 均表現出更高的增殖潛力，且在 2h時出現峰值（圖1 C、D）。通過劃痕愈合試驗檢測BMSCs的橫向遷移能力，發現接受條件培養基的細胞在第2h內顯示更大的橫向遷移能力（圖1 E）。這說明，來自張力刺激的 RAW 264.7 細胞的條件培養基顯著促進了 BMSCs 的增殖和遷移，表明它可能通過增強干細胞歸巢對組織愈合產生積極影響。

圖1     張力下的巨噬細胞條件培養基促進了 BMSCs 的增殖和遷移。

接下來，為了研究巨噬細胞免疫反應對成骨分化的影響，在不同暴露時間的張力下在各自的條件培養基中刺激BMSCs向成骨細胞分化。值得注意的是，2h張力組BMSCs的成骨潛力顯著增加，成骨相關標記物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白質表達水平顯著上調。這說明，在免疫環境中，2h的拉伸應變可能通過控制 M2 巨噬細胞極化來促進成骨。

為了確定為什么施加應力會影響巨噬細胞極化，實驗檢測了鈣離子信號，發現與其他通道相比，Piezo1的表達非常高。因此，研究人員假設張力誘導的巨噬細胞極化與Piezo1介導的鈣內流密切相關。根據RT-PCR和細胞免疫熒光結果，Piezo1在應變2h后顯著升高。通過敲低 Piezo1，發現了 p53 信號通路，與對照組和其他時間段相比，張力刺激1h后乙酰化p53的熒光強度非常高。

然而，p53的乙酰化以及巨噬細胞極化是否可能受到機械應力的影響還不確定，因此敲低Piezo1以研究其是否對p53及其乙酰化有影響，發現敲低Piezo1增加了乙酰化p53的表達。由于乙酰化 p53 與 iNOS 的變化一致，實驗又探討了Piezo1 缺失是否會改變巨噬細胞極化，發現敲低Piezo1后張力刺激下RAW264.7細胞中促炎基因和M2巨噬細胞標志物顯著下調。通過建立對照組、Piezo1敲低組和Yoda1激活Piezo1組，發現Piezo1激活組的巨噬細胞幾乎全部為M2型，Piezo1敲低組的iNOS表達量幾乎是對照組的一半。這些數據表明，Piezo1 對于巨噬細胞極化為 M2 表型至關重要。

有趣的是，Piezo1 敲低導致鈣內流減少，在向培養基中加入 1 μL/mL Yoda1 和 2h機械張力刺激后，巨噬細胞中鈣內流顯著增加（圖2 A）。此外，BMSCs的遷移和增殖與鈣內流的趨勢相一致，應變2h后Yoda1 的給藥對 BMSCs 遷移的影響最大。Piezo1敲低后，巨噬細胞的條件培養基對BMSCs幾乎沒有影響（圖2 B、C）。進一步檢測BMSCs的成骨分化能力，發現在相同條件下，Piezo1過表達后，巨噬細胞的上清液大大增加了BMSCs的成骨能力。相反，在巨噬細胞張力暴露2h后，敲低Piezo1對條件培養基中的BMSCs幾乎沒有影響（圖2 D-F）。總體而言，Piezo1對機械力的傳遞至關重要，甚至可以調節機械張力是否會影響巨噬細胞極化，從而影響BMSC的遷移、增殖和成骨分化。

圖2    Piezo1敲低抑制BMSCs的增殖、遷移和成骨分化。

巨噬細胞極化后產生TGF-β1等對BMSC成骨有影響的細胞因子，因此評估了巨噬細胞分泌的TGF-β1在張力下的mRNA和蛋白水平。結果表明，機械張力可以刺激TGF-β1的分泌，特別是在2 h。在向間接共培養系統加入不同劑量的TGF-β1抗體12-48h后，不同處理組的BMSCs增殖潛力均顯著降低，遷移能力也顯示相似的趨勢。此外，TGF-β1抗體處理顯著降低了BMSCs的成骨表達。這表明，機械張力導致巨噬細胞向M2極化并釋放TGF-β1，進而促進BMSCs的遷移、增殖和成骨分化。

最后，研究人員建立了一個小鼠運動模型來研究 Piezo1 和 TGF-β1 在骨再生過程中的作用，分為久坐小鼠（對照組）和運動小鼠，并注射水、Piezo1 抑制劑（GsMTx-4）或 TGF-β 受體 I、II 抑制劑（LY-364947）。結果顯示，跑步顯著增加了小鼠的骨量，但當Piezo1被抑制時，機械力傳遞也停止了，且GsMTx-4注射組的骨量與對照組幾乎相同。巨噬細胞釋放的TGF-β1在TGF-β受體I、II被阻斷后未能發揮作用，導致小鼠脛骨骨修復受損（圖3 A）。HE染色結果顯示，跑步組骨小梁數量顯著增加，然而，對照組和接受藥物注射組的骨小梁明顯減少（圖3 B）。免疫熒光染色顯示，跑步可顯著提高F4/80+ 陽性巨噬細胞的TGF-β1分泌，但Piezo1抑制劑顯著阻礙了這種作用（圖3 C）。因此，抑制Piezo1大大降低了巨噬細胞分泌的TGF-β1，從而減少了運動引起的體內骨量增加。

圖3    TGF-β1和Piezo1的敲低均可降低跑步小鼠的骨重塑。

  圖4    圖形概要。Piezo1介導的機械張力刺激巨噬細胞極化和TGF-β1的分泌，促進成骨分化。p53的乙酰化和去乙酰化在這個過程中起著重要作用。

總之，該研究發現機械力通過Piezo1介導鈣內流、p53乙酰化和去乙酰化的變化，誘導巨噬細胞向M2極化，分泌TGF-β1并促進BMSCs成骨。這表明 Piezo1 介導的巨噬細胞機械信號傳導是骨骼免疫學的基礎，為今后臨床治療骨外傷、骨質疏松和頜骨牽引提供線索。

參考文獻：Cai G, Lu Y, Zhong W, Wang T, Li Y, Ruan X, Chen H, Sun L, Guan Z, Li G, Zhang H, Sun W, Chen M, Zhang WB, Wang H. Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1. Cell Prolif. 2023 Sep;56(9):e13440. doi: 10.1111/cpr.13440. Epub 2023 Mar 7. PMID: 36880296; PMCID: PMC10472522.

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