Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis

Subject terms: Cell biology, Systems biology

動脈粥樣硬化是一種主要影響動脈的多因素慢性炎癥性疾病。內皮細胞功能障礙和炎癥在動脈粥樣硬化的發生和進展中起著至關重要的作用。血管內層的內皮細胞與血液直接接觸，并因各種風險因素（如高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓、吸煙和衰老）而變得功能失調和發炎，尤其是在與血流紊亂相關的特定動脈粥樣硬化易發區域。這些區域的擾動流的特征是向內皮細胞表面傳遞低幅度的振蕩剪切應力（OSS）。內皮細胞通過機械感應受體（機械傳感器）檢測各種剪切應力模式和幅度，并將這些機械信號轉化為細胞信號和隨后的結構和功能反應。

在這些內皮炎癥部位，循環單核細胞與內皮細胞結合并遷移到內皮下空間，分化成巨噬細胞。這些區域還顯示出對循環低密度脂蛋白（LDL）膽固醇的滲透性增加，LDL 膽固醇在內皮下被氧化并被附近的巨噬細胞攝取，從而促進泡沫細胞發育并引發炎癥和巨噬細胞積累的惡性循環。此外，這些區域的血管平滑肌細胞（VSMCs）轉化為合成表型并遷移到內皮下層增殖，導致動脈壁增厚。一些 VSMCs 轉化為泡沫細胞，最終導致脂質條紋和纖維脂肪斑塊的形成（圖1 a）。隨著動脈粥樣硬化斑塊向外和向內生長、成熟和進展，一些斑塊破裂，導致嚴重的心血管事件，如心肌梗塞和中風。

目前，控制致動脈粥樣硬化內皮細胞功能障礙和炎癥的血流調控（血流敏感）的基因、蛋白質和通路可能成為有希望的新治療靶點。為此，美國埃默里大學-佐治亞理工Wallace H. Coulter生物醫學工程系團隊的一項綜述討論了當前關于血流敏感基因、蛋白質和通路的研究進展，包括與內皮功能障礙和動脈粥樣硬化有關的紊亂血流誘導的內皮細胞重編程（FIRE）的新興概念。研究成果發表于 Nature Reviews Cardiology 期刊題為“Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis"。

圖1    動脈粥樣硬化優先發生在血流紊亂的部位。

內皮細胞的剪切應力

血管內皮細胞不斷暴露在血流動力學力下：血壓引起的動脈壁正常（跨壁）應力和周向應力，以及血流引起的內皮表面的切向剪切應力（圖1 b）。雖然血管壁中的跨壁壓力和周向應力主要影響和調節內側 VSMCs，但流體剪切應力主要影響內皮細胞，有效調節其功能。

由于復雜的血管幾何形狀和血流動力學條件，血管系統不同區域的剪切應力水平和方向模式差異很大（圖1 c）。在人體動脈的直段、非分支區域，血流的粘性力超過慣性力，導致穩定的單向層流，從而向內皮細胞提供高幅度的 ULS （~15 dyn/cm2）。相反，在彎曲和分支區域，慣性力變得更加突出，導致紊亂的多向振蕩流，將低幅度的 OSS（約 ±4 dyn/cm2）輸送到內皮細胞表面（圖1 d）。

血流的臨床意義在于，動脈粥樣硬化優先發生在彎曲或分支的血管區域，這些區域暴露于流動受干擾的環境，并存在其他危險因素，如高膽固醇血癥和糖尿病。

血流誘導的動脈粥樣硬化的動物模型

臨床觀察強烈表明，血流紊亂與動脈粥樣硬化發生部位之間存在相關性，但其是否直接導致動脈粥樣硬化一直是未知的，直到在動物模型的實驗研究中得到證實。在部分頸動脈結扎術（PCL）模型中，左頸動脈（LCA）誘導血流紊亂，具有典型的低幅度 OSS 模式（圖2 a）。在高脂飲食誘導高膽固醇血癥的Apoe?/? 小鼠或過表達PCSK9的C57BL/6小鼠中，PCL 手術在 2-3 周內導致整個 LCA 長度的動脈粥樣硬化快速發展。重要的是，在該小鼠模型中，對側右頸動脈（RCA）繼續暴露于穩定的血流中，且不會形成動脈粥樣硬化斑塊，是同一動物的理想對照（圖2 b）。此外，收縮頸動脈袖帶模型涉及在 RCA 的一部分上植入剪切應力修改模型（圖2 b），它將 RCA 的該部分暴露于三種不同的剪切應力狀態下：低幅度、穩定的血流，這會誘導易損斑塊的發展；高幅度、穩定的血流，無斑塊形成；以及紊亂血流，這會導致穩定性斑塊的發展。該小鼠模型顯示了單頸動脈內血流依賴性動脈粥樣硬化的發展（圖2 b）。這兩種動物模型已在全球眾多實驗室中使用，是研究體內血流依賴性內皮細胞功能和動脈粥樣硬化機制的極其有價值的工具。

除了這些受干擾血流誘導的動脈粥樣硬化的小鼠模型外，斑馬魚也被用作一種遺傳上易于處理的模型，用于檢查動脈粥樣硬化發生的早期事件。結合基因操作方法減少血流量，斑馬魚模型提供了進一步的證據，證明在高膽固醇血癥條件下，血流紊亂會導致動脈粥樣硬化。

此外，已經開發了許多剪切應力的體外模型，包括錐板粘度計、平行板流室和微流體通道。這些體外生物反應器將內皮細胞暴露在各種剪切條件下，可用于在明確的生物力學環境中確定剪切應力依賴性內皮功能的詳細機制（圖2 c、d）。

圖2    血流紊亂誘導的動脈粥樣硬化模型。

血流調節內皮功能

體內內皮細胞不斷暴露于各種血流動力學因素，尤其是與血流相關的剪切應力，它有效地調節了內皮細胞功能的幾乎所有方面。明確穩定血流保護內皮穩態功能和紊亂血流誘導內皮功能障礙的機制對于了解血流依賴性動脈粥樣硬化的發病機制和開發新的治療方法至關重要。

穩定流通過控制緊密連接蛋白表達和與肌動蛋白細胞骨架的附著來促進緊密連接穩定性，以及通過 VE-鈣粘蛋白的磷酸化和降解來控制粘附連接完整性，從而調節內皮細胞通透性。擾動流通過多種機制增加內皮細胞增殖和細胞凋亡，包括下調腫瘤抑制蛋白 p53 的表達和抑制抗凋亡激酶AKT。穩定流通過 sirtuin 1 依賴性和 FOXO1 依賴性通路誘導自噬，為內皮細胞提供細胞保護機制。擾動流通過 p53 依賴性和 sirtuin 1 依賴性機制誘導內皮細胞衰老，從而減少內皮細胞遷移并破壞動脈修復機制。

血流還調節內皮細胞的新陳代謝和氧化還原反應。雖然穩定血流會降低內皮葡萄糖攝取和代謝活性以及編碼糖酵解相關蛋白質的基因的表達，但紊亂血流會促進糖酵解代謝，導致明顯不同的代謝組學特征和線粒體裂變增加。擾動流還增加了內皮活性氧（ROS）的生成和氧化應激。在動脈粥樣硬化和高血壓的情況下，內皮響應擾動流的ROS 生成會增加血管氧化應激和 LDL 氧化。

血流紊亂還有效誘導內皮細胞炎癥和內皮細胞的轉分化，這在動脈粥樣硬化的發生和發展中起著至關重要的作用。擾動流通過增加內皮粘附分子（VCAM1、ICAM1 和 E-選擇素）的表達來誘導內皮炎癥，這些分子介導單核細胞與內皮細胞的粘附。此外，擾動流促進了細胞因子和趨化因子的表達，如 IL-1、IL-6 和 CCL5。血流紊亂可誘導內皮細胞向間充質細胞的轉分化（內皮細胞到間充質細胞的轉變；EndMT）和免疫樣細胞（內皮細胞到免疫細胞轉變；EndIT）。

機械傳感器和機械轉導

內皮細胞通過位于細胞頂端和基底表面、細胞間連接處和細胞內的機械傳感器識別流體剪切應力（圖3）。在頂端表面，機械傳感器包括質膜蛋白，如陽離子通道 PIEZO1 和 P2X 嘌呤受體4、NOTCH1、蛋白激酶、G 蛋白偶聯受體和叢狀蛋白D1，以及膜相關結構，如小窩、糖萼和初級纖毛。

在細胞間連接處，血小板內皮細胞粘附分子（PECAM1）、VE-鈣粘蛋白和 VEGFR2 形成連接機械感覺復合物，該復合物通過 PI3K-AKT 信號介導整合素激活、細胞排列和 eNOS 激活，以響應穩定血流。

在內皮細胞的基底表面，血流誘導細胞外基質結合整合素機械傳感器的構象激活和表達變化。穩定的血流會激活整合素αvβ3，導致與細胞外基質的結合增加，下游 RHO 信號轉導失活。此外，細胞質中的肌動蛋白細胞骨架已被證明用作機械感覺結構。

圖3     內皮細胞中的機械傳感器和機械信號轉導通路。

紊亂血流誘導的內皮細胞重編程

該研究人員對 PCL 手術后同一只小鼠的 LCAs（暴露于擾動流 2 天或 2 周）和 RCAs（暴露于穩定流 2 天或 2 周）獲得的單細胞進行了研究，以血流依賴性和時間依賴性方式鑒定內皮細胞和其他細胞類型的差異轉錄組學和表觀基因組變化。scRNA-seq 和 scATAC-seq 結果獨立顯示，擾動流以時間依賴性方式誘導小鼠頸動脈細胞組成的動態變化。

頸動脈包含八個內皮細胞簇、四個單核細胞-巨噬細胞簇、一個 VSMC 簇、一個成纖維細胞、一個樹突狀細胞和一個 T 細胞，所有這些細胞在細胞身份和數量方面都以血流依賴性和時間依賴性方式變化。最有趣的是，頸動脈內皮細胞在響應血流時是異質的和動態的。在暴露于生理穩定血流條件下的 RCA 中，鑒定出四個內皮細胞亞簇（E1-E4），并隨著時間的推移保持不變。然而，在暴露于促動脈粥樣硬化擾動流條件的 LCA 中，大多數健康的內皮細胞亞簇（E2-E4）幾乎丟失，而新的內皮細胞亞簇（E6 和 E8）出現。此外，在 RCA 內膜中發現的 VSMCs 很少，但正如預期的那樣，紊亂的血流增加了 LCA 中的 VSMCs 數量。在 LCA 和 RCA 中均發現成纖維細胞，在 2 天擾動流條件下，LCA 中發現的數量最高。盡管單核細胞和巨噬細胞簇在 RCA 中很少見，但 LCA 的單核細胞和巨噬細胞數量顯著增加，反映出血流紊亂時血管發生了實質性的促炎和促動脈粥樣硬化改變。與巨噬細胞一樣，RCA 中存在很少的樹突狀細胞和 T 細胞，但它們的數量因 LCA 中的擾動流而增加。

為了了解擾動流誘導內皮細胞表型變化的潛在機制，分析了 8 個不同的內皮細胞簇的差異基因表達和基因本體論。正如預期的那樣，典型健康內皮細胞簇（E2）表達兩個最著名的機械敏感基因 Klf2 和 Klf4 的較高水平，并且這些基因在暴露于擾動流的內皮細胞簇中表達顯著降低，如 LCA 中的 E8。擾動流誘導了內皮細胞 E8 簇中基因的表達，這些基因在 VSMCs（Acta2 和 Tagln）、成纖維細胞（Dcn1）和免疫細胞（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa 和 H2-Ab1）中也高度表達，表明內皮細胞在血流紊亂條件下可能發生EndMT并獲得免疫細胞樣特征。通過 Panther 基因本體分析比較穩定流暴露的 E2 和擾動流暴露的 E8 簇之間的差異表達基因，發現擾動流誘導許多與促動脈粥樣硬化通路相關的已知生物過程，包括炎癥、EndMT、細胞凋亡、血管生成和內皮通透性。偽時間軌跡分析和其他差異基因表達和染色質可及性分析證實，E8 細胞比 E2 細胞表達更高水平的 EndMT（Acta2、Cnn1、Snai1 和 Tagln）和 EndIT（C1qa、C1qb、C5ar1 和 Tnf） 標記基因。此外，體外培養的人主動脈內皮細胞長期暴露于擾動流誘導了 EndMT 標志物（SNAI1 和 TAGLN）和 EndIT 標志物（C1QC 和 C5AR1）的表達，表明擾動流可以在沒有任何其他細胞類型（如免疫細胞）的情況下誘導培養的主動脈內皮細胞重編程。這些結果表明，紊亂的血流誘導內皮細胞轉變為促動脈粥樣硬化表型，其特征是炎癥、EndMT 和 EndIT（即 FIRE）（圖4）。

圖4     單細胞 RNA 測序顯示受擾動流誘導的內皮細胞重編程。

總之，來自血流的剪切應力有效調節內皮細胞的表型和功能變化，從而阻止或促進動脈粥樣硬化形成。內皮細胞通過介導各種機械信號轉導途徑的機械傳感器轉導這些生物力學線索，進而調節轉錄組和表觀基因組變化以及細胞功能。高通量組學結合體內和體外實驗模型的出現揭示了許多調節內皮細胞功能障礙和動脈粥樣硬化發展的血流敏感基因、蛋白質和通路。穩定血流誘導動脈粥樣硬化保護性內皮細胞表型，而血流紊亂誘導動脈粥樣硬化表型，其特征是內皮形態和屏障功能改變、內皮代謝受損、氧化還原調節、增殖和細胞凋亡、炎癥途徑誘導以及轉分化為其他細胞類型，例如 EndMT。此外，體內 scRNA-seq 和 scATAC-seq 研究表明，擾動流不僅會誘導內皮炎癥和 EndMT，還會誘導 EndIT，研究人員將其定義為 FIRE（血流誘導的內皮細胞重編程）。FIRE 在內皮功能障礙和動脈粥樣硬化中的機制和作用是未解之謎，調節 FIRE 的血流敏感分子可能是新的治療靶點。

參考文獻：Tamargo IA, Baek KI, Kim Y, Park C, Jo H. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023 Nov;20(11):738-753. doi: 10.1038/s41569-023-00883-1. Epub 2023 May 24. PMID: 37225873; PMCID: PMC10206587.

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