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Transwell細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用于研究細(xì)胞遷移、侵襲、趨化及共培養(yǎng)的體外檢測(cè)方法，其核心原理是通過(guò)聚碳酸酯膜分隔上下培養(yǎng)室，模擬體內(nèi)微環(huán)境以觀察細(xì)胞行為。以下是基于證據(jù)的綜合解析：

一、實(shí)驗(yàn)原理

1. 基本結(jié)構(gòu)：Transwell小室由上下兩室組成，中間以通透性膜（孔徑通常為0.8-12 μm）隔開。下層培養(yǎng)液中的趨化因子或血清等成分可穿過(guò)膜，誘導(dǎo)上室細(xì)胞遷移或侵襲。

2. 遷移與侵襲的區(qū)別：

• 遷移實(shí)驗(yàn)：僅需細(xì)胞穿透聚碳酸酯膜，無(wú)需額外基質(zhì)膠，適用于檢測(cè)運(yùn)動(dòng)能力。

• 侵襲實(shí)驗(yàn)：需在膜上預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠（模擬細(xì)胞外基質(zhì)），細(xì)胞需分泌蛋白酶（如MMPs）降解基質(zhì)膠后才能穿過(guò)，用于評(píng)估侵襲潛能。

二、實(shí)驗(yàn)步驟（以侵襲實(shí)驗(yàn)為例）

1. 基質(zhì)膠鋪板：

• 預(yù)冷槍頭及培養(yǎng)板，將Matrigel稀釋后（常用1:8~1:10）加入Transwell上室底部，4℃凝固5小時(shí)或37℃聚合30分鐘，形成基質(zhì)膠層。

2. 細(xì)胞準(zhǔn)備：

• 消化細(xì)胞后離心（如800 r/min，5分鐘），調(diào)整密度為1×10?~1×10?個(gè)/mL，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。

3. 接種與培養(yǎng)：

• 上室加入細(xì)胞懸液（100-200 μL），下室加入含趨化因子（如30%胎牛血清）的培養(yǎng)基（500-600 μL），37℃孵育8-24小時(shí)（時(shí)間因細(xì)胞類型而異）。

4. 固定與染色：

• 用棉簽擦除未穿透膜的細(xì)胞，多聚甲醛或75%乙醇固定，結(jié)晶紫或蘇木精染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)下室細(xì)胞。

5. 結(jié)果分析：

• 選取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，通過(guò)穿膜細(xì)胞數(shù)或熒光強(qiáng)度（如ECM554試劑盒）定量分析。

三、關(guān)鍵影響因素與注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞狀態(tài)：

• 需確保細(xì)胞活力，饑餓處理（無(wú)血清培養(yǎng)基）可減少背景干擾。

• 細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致穿膜過(guò)快，難以計(jì)數(shù)；過(guò)低則可能無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2. 實(shí)驗(yàn)條件：

• 孔徑選擇：遷移實(shí)驗(yàn)常用8-12 μm，侵襲實(shí)驗(yàn)需結(jié)合基質(zhì)膠厚度調(diào)整。

• 血清濃度：下室血清濃度需高于上室以形成趨化梯度，但過(guò)高可能加速細(xì)胞死亡。

• 避免氣泡：加液時(shí)需緩慢，防止氣泡阻隔細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

3. 基質(zhì)膠處理：

• Matrigel需4℃解凍，稀釋后快速鋪板以防凝固不均。

• 不同批次Matrigel需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化濃度。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

1. 腫瘤研究：檢測(cè)基因沉默（如LKB1）、過(guò)表達(dá)（如IncRNA-p21）或藥物處理（如SP600125）對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的影響。

2. 信號(hào)通路研究：結(jié)合Western Blot分析E-cadherin、MMPs等蛋白表達(dá)，探究EMT等機(jī)制。

3. 藥物篩選：評(píng)估化合物對(duì)細(xì)胞遷移/侵襲的抑制或促進(jìn)作用。

五、常見問(wèn)題與解決方案

1. 細(xì)胞不穿膜：

• 可能原因：細(xì)胞無(wú)侵襲能力、饑餓時(shí)間不足、上室混入血清、孔徑不匹配。

• 對(duì)策：驗(yàn)證細(xì)胞特性、延長(zhǎng)饑餓時(shí)間、優(yōu)化孔徑。

2. 結(jié)果重復(fù)性差：

• 統(tǒng)一細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，避免分組間操作差異；使用同一批次試劑。