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活性氧（ROS）檢測技術實驗是通過多種方法測量細胞內或組織內ROS水平的關鍵手段，其核心原理基于ROS與特定探針的氧化反應生成可檢測信號。以下是詳細的實驗方法及注意事項：

一、常用檢測方法

1. 熒光探針法（DCFH-DA法）

• 原理：DCFH-DA穿透細胞膜后，被細胞內酯酶水解為無熒光的DCFH，后者被ROS氧化生成綠色熒光的DCF。熒光強度與ROS水平成正比。

• 儀器：流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光分光光度計或熒光酶標儀。

• 激發/發射波長：不同試劑盒參數略有差異，常見激發波長488-502 nm，發射波長525-530 nm。

2. 組織及液體樣本檢測

• 組織樣本：使用008 ROS探針（紅色熒光，激發/發射波長510/610 nm），需優先使用新鮮組織，凍存樣本可能導致ROS損失。

• 液體樣本：采用BBoxiProbe® O11探針（綠色熒光，激發/發射波長488/516 nm），適用于細胞培養基等液體環境。

3. 線粒體特異性檢測

• 使用高內涵儀器結合化合物（如魚藤酮）干預線粒體功能，或采用MitoSOX Red探針（紅色熒光）靶向線粒體超氧化物。

4. 其他方法

• 電子順磁共振（EPR） ：檢測O??、·OH等自由基，需結合自旋捕獲技術。

• 化學發光法：利用Lucigenin等探針檢測超氧化物，無需激發光源。

二、實驗步驟（以DCFH-DA法為例）

1. 樣本準備

• 細胞類型：貼壁或懸浮細胞需調整探針裝載方式。貼壁細胞建議檢測時匯合度達50-70%。

• 組織樣本：優先使用新鮮組織，凍存樣本需驗證ROS殘留量。

2. 探針裝載

• 濃度：DCFH-DA工作液通常為5-20 μM（按1:250至1:1000稀釋母液）。

• 孵育條件：37℃避光孵育20-40分鐘，懸浮細胞需后續洗滌去除未進入探針。

• 順序調整：

• 短刺激（<4小時）：先裝載探針，后處理細胞。

• 長刺激（>4小時）：先處理細胞，后裝載探針。

3. 檢測與參數設置

• 儀器選擇：根據樣本量選擇熒光酶標儀（高通量）或共聚焦顯微鏡（亞細胞定位）。

• 陽性對照：使用Rosup（50-100 mM）驗證實驗有效性。

4. 數據分析

• 熒光強度通過軟件（如ImageJ）量化，對比處理組與對照組的差異。

三、注意事項

1. 樣本處理

• 避免反復凍融，尤其是組織樣本，否則ROS易降解。

• 檢測前用無血清培養基或PBS清洗細胞，減少背景干擾。

2. 實驗條件控制

• 溫度：光照實驗需控制溫度在20-29℃，避免溫度波動影響ROS生成。

• 避光操作：探針及樣本需全程避光，防止熒光淬滅。

3. 探針優化

• 根據細胞類型調整探針濃度，避免濃度過高導致毒性或背景信號。

• 縮短探針裝載后至檢測的時間（建議<1小時），減少假陽性。

4. 質量控制

• 設置無探針對照組、陽性對照組（Rosup）及空白組，排除自發熒光影響。

四、應用場景

• 疾病機制研究：如氧化應激與神經退行性疾病、癌癥的關系。

• 藥物評價：通過ROS水平變化評估藥物抗氧化效果。

• 環境毒理學：檢測污染物（如紫外線、化學物質）誘導的ROS累積。