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蛋白質(zhì)在生產(chǎn)和儲存過程中容易因溫度、pH及濃度的變化而發(fā)生聚集。聚集會影響如單克隆抗體（mAbs）等蛋白質(zhì)產(chǎn)品的安全性和有效性，因此需要通過專用的分析程序?qū)Ξa(chǎn)品的聚集程度進(jìn)行確認(rèn)，而尺寸排阻色譜法（SEC）是一種可用于確認(rèn)聚集的方法。在USP NF2022通則<129>中描述了使用SEC分析單克隆抗體中雜質(zhì)的方法。由于該方法采用高濃度鹽洗脫液，這可能會導(dǎo)致儀器因?yàn)槌恋砗透g而損壞，因此本文介紹了采用生物惰性高效液相色譜儀Nexera lite inert系統(tǒng)進(jìn)行USP合規(guī)的單克隆IgG抗體SEC分析，此系統(tǒng)比使用不銹鋼部件的HPLC更耐鹽和酸。

Nexera lite inert系統(tǒng)優(yōu)勢

• 優(yōu)異的靈敏度和回收率——更大限度降低因金屬吸附而造成的損失

• 出色的耐受性和分離度——輕松應(yīng)對高鹽濃度和極端pH流動相的挑戰(zhàn)

• 更高的可靠性和重現(xiàn)性——避免金屬管路對化合物的吸附

應(yīng)用

前處理

樣品：通過向2mg單克隆IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品中加入200μL的洗脫液，制備測試樣品，使其濃度達(dá)到10mg/mL，進(jìn)行分析。

分析條件

色譜柱 ：TSKgel G3000 SWXL（300mm×7.8mm I.D.，5μm）

洗脫液 ：200mmol/L磷酸鉀緩沖液（含250mmol/L氯化鉀水溶液，pH=6.2）

流速   ：0.5mL/min

柱溫   ：25℃

進(jìn)樣量 ：25μL

檢測器 ：UV，280nm

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

① 校準(zhǔn)曲線及色譜圖：圖中顯示了單克隆IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg/mL）色譜圖（黑色）和校準(zhǔn)曲線（藍(lán)色）。色譜圖中四個色譜峰的洗脫順序符合USP中規(guī)定的各色譜峰洗脫要求。校準(zhǔn)曲線分子量范圍為13.7kDa~500kDa。

單克隆IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg/mL）色譜圖（黑色）和校準(zhǔn)曲線（藍(lán)色）

② 峰面積：采用面積歸一化法對各峰面積進(jìn)行分析。高分子量（聚合物+二聚體）峰面積為0.53%，單體峰面積為99.4%，小分子碎片峰面積為0.04%，均符合USP規(guī)定中對物質(zhì)峰面積的系統(tǒng)適應(yīng)性規(guī)定。

峰面積結(jié)果

③ 重現(xiàn)性：對單克隆IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)6次進(jìn)樣分析，保留時間重現(xiàn)性RSD為0.03%，峰面積重現(xiàn)性RSD為0.01%，重現(xiàn)性良好。

保留時間及峰面積結(jié)果（n=6）

結(jié)論

采用Nexera lite inert系統(tǒng)進(jìn)行符合USP規(guī)定的單克隆IgG抗體的SEC分析。分析結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)均符合USP規(guī)定中對系統(tǒng)適應(yīng)性的要求。峰面積重現(xiàn)性RSD為0.01%，保留時間重現(xiàn)性RSD為0.03%，表明在高濃度鹽洗脫液條件下，Nexera lite inert系統(tǒng)仍然提供良好的分析重現(xiàn)性，有助于抗體藥物的分析。

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