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產品描述

Annexin V-647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標記早期凋亡細胞（遠紅）和壞死細胞（紅色），用于檢測細胞凋亡水平。產品可以使用流式細胞儀或其它熒光檢測設備進行檢測。

Annexin V-647可以標記凋亡細胞。Annexin V選擇性結合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱 PS)。在細胞發生早期凋亡時，PS 會外翻到細胞表面，即細胞膜外側。用遠紅色熒光探針647 標記的 Annexin V，即 Annexin V-647，可以結合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測細胞凋亡的重要特征。我們公司的647染料與普通熒光素相比，熒光亮度更高，且不受環境中 pH 的影響，具有良好的光穩定性。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結合染料，它可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞的細胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發，呈現紅色熒光。

訂購信息

保存方法

冰袋運輸，4℃避光保存，保質期12個月。

使用方法

   下列實驗方案以利用星形孢菌素誘導Jurkat細胞凋亡為例，如果使用其他誘導劑和其他類型的細胞，實驗條件需要略作調整。

1.流式細胞檢測

（1）根據實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經處理的細胞樣品，作為陰性對照。此外，設定一組樣品做單染，用于調節補償。

（2）收集細胞。懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞；貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后300 g，4℃離心5 min收集細胞，胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

注：用胰蛋白酶消化然后使細胞在合適的細胞培養條件和培養基中恢復約30分鐘，然后再染色。胰蛋白酶消化會暫時破壞質膜，允許Annexin V結合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞質表面上，從而導致假陽性染色。

（3）用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次均在300 g，4℃下離心5 min，收集1-5×105個細胞并用100μL 1×結合緩沖液重懸細胞。

（4）每管加入 4-5μL的Annexin V-647和5μL的PI工作液。

注：我們推薦準備兩管額外的流式管，每管中只加入一種單染染料（Annexin V-647和PI各一管），用于流式的補償調節。

（5）室溫避光孵育 10-15 min，為避免影響細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作。

（6）每管加入400μL的PBS或1×結合緩沖液，盡快通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。Annexin V-647可以由647 nm激光激發，檢測熒光發射光譜約在647 nm處（APC通道），PI發射光譜約在617 nm處。

2.熒光顯微鏡檢測

   對于懸浮細胞，可參照流式細胞檢測的方法進行具體操作。

（1）在蓋玻片或載玻片小室中接種細胞。

（2）根據實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經處理的細胞樣品，作為陰性對照。

（3）用PBS 洗滌細胞。

注：細胞收集后如果不用PBS清洗，可以用含血清的培養基直接替代Annexin V結合緩沖液，但是 Annexin V的使用濃度需要重新優化。

（4）每 100 μL的Annexin V結合緩沖液中加入5-25μL的Annexin V-647和 5μL的PI。

注：適宜使用濃度由具體實驗要求確定。

（5）向培養板中加入足量的染液以覆蓋全部細胞，室溫避光孵育15-30 min。為避免影響細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至30 min。

（6）用 1×結合緩沖液清洗細胞。

（7）將孵育有細胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結合緩沖液；對于培養在小室內的細胞，可直接加入足量的 1×結合緩沖液覆蓋細胞。

（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細胞。Annexin V-647可用 APC 適用的濾光片，PI可用 Cy3或者Texas濾光片。

注意事項

熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。